不同轉染試劑包裝慢病毒效果研究

唐 俊 孫雪娟 譚 翠

(1.重慶醫科大學附屬第一醫院分子腫瘤及表觀遺傳學重慶市重點實驗室 重慶 400016；2.重慶醫科大學附屬第一醫院研究生管理處 重慶 400016)

細胞轉染技術，是指人為地將外源性基因分子如DNA、RNA等導入真核細胞內的一種技術。隨著細胞生物學和分子生物學的飛速發展及基因與蛋白功能的研究深入，轉染已經成為實驗室工作中經常涉及的基本實驗方法。目前，細胞轉染技術主要分為三類途徑：物理介導、化學介導和生物介導。物理方法包括電穿孔法、顯微注射和基因槍等；化學介導方法種類較多，如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術等；生物介導方法，有較為原始的原生質體轉染以及現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。與其他途徑相比，慢病毒體系作為生物介導的方法之一，因其安全性高、免疫赦免小、可重復性強、能夠攜帶大基因片段且可長期穩定表達等優點，被廣泛應用[1]。慢病毒包裝中常用的轉染試劑有PEI、脂質體等。聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，因其可以縮聚DNA分子形成顆粒，常被用于真核細胞的轉染。脂質體是磷脂分散在水中形成的脂質雙分子層，又稱為人工生物膜，可將DNA分子包裹在內形成DNA-脂復合物，適用于各種懸浮或貼壁細胞，轉染效率較高。

本實驗采用兩種轉染試劑PEI和LipoD293作為研究對象，將攜帶CMV啟動子和綠色熒光蛋白GFP（green fluorescent protein）標記的慢病毒質粒包裝成慢病毒液，通過對比觀察包裝及病毒液感染后，293T細胞中熒光蛋白表達強弱來比較兩種脂質體的慢病毒包裝效果，為慢病毒包裝過程中轉染試劑的選擇提供實驗依據。

一、材料與方法

（一）主要儀器及試劑

細胞培養基Dulbecco’s modification of Eagle medium(DMEM)、減血清培養基Opti-MEM、Fetal Bovine Serum (FBS)、胰蛋白酶、高速離心機Micro17均購自美國Thermo Fisher公司，脂質體LipoD293購自SignaGen公司，激光共聚焦顯微鏡TCSSP8購自德國Lei Ka公司，PEI購自polysciences公司，將PEI終濃度配置成1mg/ml，置于-20℃保存。

（二）質粒

慢病毒質粒pLenti-C-mGFP由OriGene公司構建，包裝質粒psPAX2、pMD2G由南開大學饋贈。

（三）細胞株及培養條件

293T細胞購自ATCC，由實驗室細胞庫凍存。培養基為含10%FBS的DMEM，置于37℃、CO2含量為5%的細胞培養箱中。

（四）慢病毒包裝

1.細胞傳代及種板

對數生長期293T細胞匯合90%時，去除上清，加入2ml PBS，輕輕晃動后去除，加入1ml0.1%胰酶，置于生物安全柜中室溫消化30s，待大部分細胞變圓后，輕拍瓶底，使細胞漂浮，加入1ml培養基終止消化。將細胞懸液倒入離心管中，1000r離心5分鐘，棄上清，加入培養基，以1.5*106接種于六孔板，共6孔，每3個孔為一組，分別標記A、B兩組，當細胞匯合達80%左右，進行轉染。

2.用PEI和LipoD293包裝慢病毒

A組用PEI轉染：①250ul Opti-MEM+PEI 7ul混勻后室溫靜置5min；②250ul Opti-MEM+質粒4.8ug(psPAX2 1.8ug、pMD2G 0.6ug、pLenti-C-mGFP 2.4ug)混勻后室溫靜置5min；③將②中質粒混合液緩慢加入①中，混勻后室溫靜置20min。

B組用LipoD293轉染：①250ul Opti-MEM+LipoD293 7.2ul混勻后室溫靜置5min；②250ul Opti-MEM+質粒4.8ug(psPAX2 1.8ug、pMD2G 0.6ug、pLenti-C-mGFP 2.4ug)混勻后室溫靜置5min；③將②中質粒混合液緩慢加入①中，混勻后室溫靜置20min。

六孔板中細胞去除原培養基，加入1ml PBS潤洗后去除，沿孔壁緩慢加入500ul Opti-MEM，再加入PEI/LipoD293與質粒的混合液，輕柔搖晃混勻后置于細胞培養箱中。A組4小時、B組6h后每孔更換為2ml完全培養基。48小時后，用激光共聚焦顯微鏡觀察每孔中細胞GFP陽性率并收集病毒液于離心管中，20000r離心20min[2]，A組病毒液標記為病毒液A，B組病毒液標記為病毒液B，每EP管分裝500ul，測定病毒滴度后，儲存于-80℃

（五）慢病毒液感染293T細胞

對數生長期293T細胞，提前一天按照1.4.1種板及分組。當細胞匯合達60%左右，進行感染。

病毒液A、B在4℃冰箱中融化后，A組加入含病毒液A的1/2體積培養基，B組加入含病毒液B的1/2體積培養基，感染16-18h后去除含病毒液上清，加入2ml完全培養基。48小時后用激光共聚焦顯微鏡觀察每孔中細胞GFP陽性率。

（六）差異及統計分析

統計分析采用SPSS 22.0軟件，進行Student t-test檢驗。P＜0.05差異有統計學意義。

二、結果與分析

在慢病毒包裝過程中，用PEI（A組）和LipoD293（B組）分別轉染293T細胞48h后，用激光共聚焦顯微鏡觀察兩組中細胞GFP表達如圖A所示。A組細胞GFP表達少于B組。

圖A

用A、B病毒液分別感染293T細胞48h后，用激光共聚焦顯微鏡觀察兩組細胞GFP表達如圖B顯示。A組細胞GFP表達明顯少于B組，即用在質粒配比相同的情況下，LipoD293包裝的慢病毒液的具有較強的感染力。

圖B

三、討論

慢病毒體系之所以作為生物介導的方式之一，主要是因為其載體可以將外源基因有效的整合到宿主細胞中，在具有更高轉染效率的同時，避免宿主細胞對外源基因的切割修飾[3]，從而達到持久穩定的表達。慢病毒病毒載體來源于人類免疫缺陷病毒，為真核細胞的修飾提供了一種有效的手段，在被廣泛研究和優化的同時，也被用于科研和臨床基因治療應用的學術實驗室[4]。然而在慢病毒的包裝過程中，無論選擇三質粒系統還是四質粒系統，都需要將幾個質粒同時轉染入細胞，因此選擇高效、經濟、安全的轉染試劑和方法以獲得高的轉染效率尤其重要。

脂質體表面帶正電荷，主要由親水性頭部、鏈接鍵和疏水性尾部三部分構成。作為一種高效的轉染試劑，首先通過靜電作用與核酸的磷酸根將DNA分子包裹在內形成DNA-脂復合物，再被表面帶負電荷的細胞吸附，通過內吞、膜的融合等方式將復合物傳遞入細胞[5]，是目前實驗室最常用的轉染試劑之一。脂質體轉染效率、生物毒性主要取決于其結構及表面的修飾[6]。本實驗選取LipoD293是脂質體中轉染試劑之一，特有的脂質體共軛結合技術，目前常用于難轉染細胞、單DNA和多DNA片段的共轉染。PEI是一種人工合成的多聚陽離子，將DNA壓縮成50-200nm大小的納米球[7]并與其形成穩定的復合物，通過無明顯障礙的粘附內吞進入細胞[8]，實現攜帶質粒的表達。從工業的原材料到轉染試劑，PEI因其價格優勢、使用方法簡單、轉染效率較高越來越多的被應用于細胞轉染技術中。但由于PEI的內吞可在細胞膜上形成團片狀物，研究表明其細胞毒性受濃度影響，大于7ug/ml加入細胞中即可引起細胞明顯死亡[9]。本實驗選取7ug/ml濃度用作GFP質粒轉染，轉染復合物與細胞作用時間為4h，并于4h、24h及48h觀察293T細胞狀態，并未見明顯細胞毒性作用。由此可見，除了PEI濃度，質粒大小、轉染復合物與細胞作用時間、被轉染細胞的狀態也是影響其毒性的重要作用。周鵬[10]等人也證實了PEI-DNA轉染復合物與細胞作用時間在4h轉染效率較6h高。

本實驗采用病毒三質粒系統，在質粒配比相同的情況下，用PEI和LipoD293包裝的慢病毒液，對比觀察包裝及病毒液感染后293T細胞中熒光蛋白表達強弱，發現轉染和病毒感染48h后，LipoD293組293T細胞的熒光蛋白表達均高于PEI組，證實在其他條件相同情況下，LipoD293包裝慢病毒效果優于PEI，可作為一種高效、經濟的轉染試劑用于慢病液的制備。