MMP19基因在5個豬群體內的多態性分析

吳華莉，曹建國，張鶯鶯，涂尾龍，王洪洋，黃 濟，談永松

（1.上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 閔行 201106；2.上海市種豬工程技術研究中心，上海浦東新區 201302）

MMPs（Matrix metalloproteinases,基質金屬蛋白酶）是一類具有鋅依賴性內肽酶同源結構域的蛋白水解酶，參與細胞外基質各種成分的降解和重建平衡，通過裂解作用釋放生長因子、細胞膜結合蛋白和細胞因子而發揮生物學作用。MMPs家族基因參與胚胎發育、繁殖和組織修復等生理過程[1]。MMP19（Matrix metallopeptidase 19）是MMPs家族成員之一，參與生長發育和疾病的細胞外基質各種成分的降解過程[2-3]。人MMP19定位于12號染色體，mRNA在人體各種組織中廣泛表達[4]。豬MMP19基因定位于5號染色體。豬MMP19全基因組長度6 340 bp，包含9個外顯子和8個內含子，mRNA在豬肝臟表達量最高，在脾臟和卵巢組織等也有高表達量[5]。有研究發現豬MMP19基因第5外顯子第203 bp處多態位點產生的不同基因型個體在生長指標、免疫指標以及眼肌高度差異顯著[6-7]。杜洛克、長白、大白和梅山豬具有良好的繁殖性能和優良的肉用性能。申農豬是上海農業科學院畜牧獸醫研究所用長白×（大白×二花臉）經橫交固定、世代選育形成的母本新品系。目前關于豬MMP19基因多態位點檢測報道較少。本試驗檢測MMP19基因第5外顯子在上海地區5個豬群體中的多態性，期望為豬繁殖、生長指標和疾病的分子育種候選基因提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

試驗于2019年7—10月在上海市農業科學院畜牧獸醫研究所進行。采集樣品品種包括杜洛克（92頭）、長白豬（76頭）、大白豬（153頭）、申農豬（72頭）、梅山豬（108頭），總計501頭；采用樣品來源于上海祥欣畜禽有限公司、上海警備區富民農場和上海豬狀元畜牧綜合場；采集部位為耳組織塊。PCR所用試劑Taq酶和MseⅠ酶購于寶生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采用AXYGEN基因組試劑盒提取組織DNA，測定DNA濃度，稀釋DNA，使每管濃度達到50 ng/mL，-20 ℃保存備用。

1.2.2 引物及PCR擴增 上游引物：5'-ACTCTG ACCGCCTTCCTC-3'；下游引物：5'-TCAAGCCC GAAGAGGTGC-3'[5]。PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物由1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，要求目的條帶單一明亮無雜帶，符合條件的PCR產物進行酶切試驗，采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。

1.2.3 基因型分析 豬MMP19基因PCR擴增片段為354 bp，存在MseⅠ酶切位點，基因型判定標準見表1。

表1 MMP19基因酶切后基因型判定標準

2 結果與分析

2.1 PCR-RFLP檢測

用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，目的條帶大小與預期一致。圖1顯示，TT型為1條帶，CC型為2條帶，TC型雜合子為3條帶。根據電泳檢測結果統計每個個體的基因型。

圖1 MMP19基因酶切檢測

2.2 MMP19基因在5個豬群體內的基因型頻率和等位基因頻率

采用PCR-RFLP技術，MMP19基因在5個豬群體內的多態性檢測結果見表2。由表2可見，MMP19基因第5外顯子多態性在5個豬群體內的基因型頻率和等位基因頻率表現為：在杜洛克和長白豬群體內檢測出CC型為主要基因型，雜合子TC基因型略少，只有少量TT基因型，C等位基因為優勢等位基因；在大白豬和申農豬群體內占優勢的是CC基因型和C等位基因；在梅山豬群體內TC型為主要基因型，CC基因型略少，只有少量TT基因型。本研究結果顯示，MMP19基因在杜洛克、長白和梅山豬群體內檢測出3種基因型，在大白和申農豬群體內檢測出2種基因型。

表2 MMP19基因在5個豬群體內的基因型頻率和等位基因頻率

3 討論

趙永貞研究結果表明，CC型個體平均日增重、滴水損失和眼肌高度顯著高于TC型[5]。本研究檢測MMP19基因在杜洛克、長白、大白和申農豬群體內CC型為優勢基因型，其中在大白豬群體內CC型頻率為0.97。這一結果暗示杜洛克、長白、大白和申農豬群體的生長性能良好。在5個豬群體內C等位基因占優勢，這與唐中林檢測C等位基因在長白和大白群體中占優勢的結果是一致的[6]。豬MMP19基因第5外顯子的TC型個體白細胞數、血紅蛋白濃度和IgG2濃度高于CC型，是因為該區域存在與豬早期平均增長率相關數量性狀基因座（QTL）以及與抗K88大腸桿菌的IgG2水平相關QTL[6]。有研究證實，鼠MMP19 mRNA在濾泡生長、排卵和黃體溶解過程發揮重要作用[7]。豬MMP19基因第5外顯子T/C突變位點已被證實與平均日增重、肉質性狀的滴水損失、嫩度和眼肌高度顯著相關，并且與脂肪性狀內脂率相關，與免疫指標白細胞數（WBC）和IgG2含量顯著相關[8]。豬MMP19 mRNA在豬胚胎背最長肌表達量隨發育時間增加而逐漸增加[6]。這些研究都表明，MMP19基因第5外顯子的多態性與豬的生長指標、肉質性狀和抗病性能有關，可作為豬育種的分子遺傳標記加以深入探究。本試驗結果顯示，TC型頻率在大白豬群體很低，在梅山豬群體達0.84，在杜洛克、長白和申農豬群體內TC型頻率約為0.4，而TT型個體在杜洛克、長白和梅山豬群體檢測頻率很低，在大白和申農豬群體均未檢測出TT型。趙永貞證實TC型個體白細胞數（WBC）和IgG2濃度顯著高于TT型（P<0.05），TC型的WBC、血紅蛋白濃度（HGB）和IgG2高于CC型，但未達到差異顯著水平[5]。這說明除大白豬群體外，梅山豬、杜洛克、長白和申農豬群體內與免疫指標相關的TC型頻率較高，進一步研究可測定這些豬群體的生長指標、繁殖性能指標以及免疫指標并進行相關分析，以期為分子育種提供參考數據。