湖南岳陽豬葡萄球菌分離鑒定及耐藥性分析

范方程，王 文，彭娜娜，寧慧敏，董 偉

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128）

仔豬滲出性皮炎又稱“豬油皮病”，該病是由豬葡萄球菌（Staphylococcus hyicus）感染所引起，不同階段豬群對該病均易感，但多發(fā)于斷奶仔豬和哺乳仔豬。仔豬感染該病后臨床癥狀主要表現(xiàn)為消瘦、厭食、脫毛、皮膚表面紅斑和漿液滲出形成濕疹性皮炎和滲出性皮炎等，嚴重時可導致發(fā)病豬脫水死亡[1]。仔豬滲出性皮炎的發(fā)生無明顯的地域性和季節(jié)性，但在夏季和秋季多發(fā)，存在高發(fā)病率和死亡率的特點，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[2]。此外，豬葡萄球菌也可感染人，但相關案例較為少見[3]。

目前我國養(yǎng)豬模式正逐漸從散養(yǎng)化向規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖過渡，但大規(guī)模養(yǎng)殖容易導致疫病多發(fā)。豬葡萄球菌在豬場中十分常見，但該病感染導致的臨床癥狀（仔豬滲出性皮炎）容易與其它疾病混淆，如豬疥螨病[4]。因此對于豬病的診斷，我們需要在臨床診斷的基礎上借助實驗室技術進行診斷與分析，以快速而準確地對致病原進行確診，為疾病的防治提供依據(jù)。2020年4月初，湖南岳陽某規(guī)?；i場部分仔豬發(fā)生滲出性皮炎，筆者通過臨床觀察結合實驗室技術診斷結果，最終確定該病由豬葡萄球菌感染引起，且進一步試驗發(fā)現(xiàn)該致病菌對部分抗生素具有耐藥性，其研究結果為該病的進一步防控提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 湖南岳陽某規(guī)模化豬場飼養(yǎng)繁殖母豬400余頭，2020年4月初該場產(chǎn)房部分欄舍仔豬出現(xiàn)滲出性皮炎，且有數(shù)十頭仔豬死亡。為探究發(fā)病原因，該場獸醫(yī)于4月中旬無菌采集病死豬心臟、肺臟和病變皮膚組織送至湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院進行病原診斷。

1.1.2 主要試劑 細菌基因組DNA抽提試劑盒、2×Taq master mix、DL 5 000 DNA Marker等試劑均購自于TakaRa公司；藥敏紙片購自于杭州微生物試劑有限公司；葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖和果糖等購自于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原分離與革蘭氏染色鑒定 使用滅菌眼科剪和手術刀切取少量心臟、肺臟和皮膚病變組織混合后切碎，與適量滅菌生理鹽水混合，加入磁珠高速勻漿，離心后取上清液。在無菌操作臺用滅菌接種環(huán)蘸取少量上清液接種在普通瓊脂培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基表面是否有菌落形成。如果有，則用革蘭氏染色法對分離菌株進行染色，隨后在光學顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。

1.2.2 生化鑒定 將分離的菌株接種于普通培養(yǎng)基進行培養(yǎng)與純化，然后將單一菌落分別接種在葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、果糖等微量生化鑒定管，37 ℃培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計試驗結果。

1.2.3 分離菌株16S rRNA基因序列擴增及測序 根據(jù)參考文獻[5]合成用于PCR擴增細菌16S rRNA基因序列通用引物，16S rRNA-27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；16S rRNA-1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'，引物由北京擎科生物科技有限公司長沙分公司合成。

將分離菌株接種在液體瓊脂培養(yǎng)基中擴增，然后取適量菌液用于DNA基因組提取，其具體步驟參考相關試劑盒說明書進行。以提取菌株基因組為模板，通過PCR法對其16S rRNA基因序列進行擴增。其PCR體系（50.0 μL）包括2×PCR mix 25 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板3 μL及雙蒸水20 μL，每次反應均設置陽性對照和陰性對照，其模板分別為已知葡萄球菌DNA和雙蒸水；擴增條件為94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應結束后取5 μL產(chǎn)物進行凝膠電泳，將PCR陽性產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司長沙分公司雙向測序。

1.2.4 分離株16S rRNA基因序列分析 將測序結果用DNA Star 5.0軟件進行拼接，其后在NCBI上下載豬葡萄球菌及其它豬常見細菌性病原的16S rRNA基因序列。應用DNA Star 5.0軟件分析本文獲得序列與參考菌株核苷酸序列同源性，同時采用MEGA 6.0軟件中的Neighbor Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 動物試驗 將12只日齡、體重和性別一致的昆明小鼠分為2組，每組6只，對組Ⅰ小鼠腹腔注射分離菌原液0.2 mL/只，組Ⅱ腹腔注射等體積的生理鹽水。對各組小鼠攻毒后觀察其臨床癥狀及體重變化等，并記錄相應的結果。

1.2.6 藥敏試驗 采用藥敏紙片擴散法對分離的致病菌進行藥敏試驗：將分離純化菌稀釋至1×108CFU/mL，取100 μL稀釋菌液均勻涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基表面，待菌液稍干，取不同藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測定不同藥敏紙片抑菌圈直徑，根據(jù)該產(chǎn)品相關判定標準對結果進行分析。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定及生化試驗結果

將病料組織勻漿后取上清液接種于普通瓊脂培養(yǎng)基中進行細菌分離，在37 ℃培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基表面長出邊緣整齊的乳白色光滑菌落；進一步革蘭氏染色結果如圖1所示：菌體呈藍紫色球狀，為革蘭氏陽性菌，部分菌體單個或成對存在，大多數(shù)菌體聚集在一起呈葡萄串狀；而生化試驗鑒定結果顯示，葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、果糖等指標為陽性，硫化氫、V-P試驗等為陰性（表1）。

圖1 分離菌革蘭氏染色鏡檢結果

表1 分離菌生化試驗結果

2.2 分離菌株16S rRNA基因序列擴增結果及序列分析

以該菌株基因組為模板，用PCR法對其16S rDNA基因序列進行擴增，凝膠電泳結果如圖2所示，該菌株16S rDNA基因PCR產(chǎn)物大小約1 500 bp，與預期片段大小基本一致，且陰性和陽性對照成立。

圖2 分離菌株16S rDNA擴增PCR產(chǎn)物凝膠電泳結果

進一步序列分析結果發(fā)現(xiàn)，該菌株16S rRNA基因序列與已知豬葡萄球菌分離株（登錄號：MW485735）同源性最高，為99.62%，但與其它細菌性病原對應序列同源性相對較低。遺傳進化分析結果如圖3所示，本試驗分離的菌株與已知豬源葡萄球菌（MW485735）同屬一個分支，由此推斷本文獲得的菌株為豬葡萄球菌。

圖3 分離株16S rRNA基因序列與相關致病菌遺傳進化分析結果

2.3 小鼠致病性試驗結果

組Ⅰ小鼠接種豬葡萄球菌5～7 d后，精神萎靡、不愿活動，肉眼可見接種部位皮膚處有被毛脫落和炎性物質(zhì)滲出，背部皮膚出現(xiàn)紅色皰疹，隨后有潰爛等，但無小鼠死亡現(xiàn)象。且與組Ⅱ小鼠相比，其體重和采食量均有所下降。

2.4 藥敏試驗結果

采用KB擴散法檢測該分離菌對不同抗生素的敏感性，結果如表2所示，分離菌株對青霉素、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢哌酮、阿莫西林、氟苯尼考、萬古霉素、多西環(huán)素、磺胺異噁唑敏感，對諾氟沙星、環(huán)丙沙星中敏，對林可霉素耐藥。

表2 分離菌株耐藥性分析結果

3 討論

豬葡萄球菌是一種機會致病菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，當動物機體免疫力下降時病原菌便可通過皮膚損傷處和皮膚黏膜感染宿主。豬是該病原的易感動物，該病感染可引起豬關節(jié)炎、敗血癥及皮膚化膿。近年來，豬葡萄球菌病在我國各地豬場均有發(fā)生，這無疑嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，同時對養(yǎng)豬從業(yè)人員健康也造成威脅。

2020年4月初，湖南岳陽某規(guī)?；i場部分仔豬暴發(fā)疑似豬葡萄球菌感染導致的仔豬滲出性皮炎，通過細菌分離、革蘭氏染色及16S rRNA基因序列擴增與分析發(fā)現(xiàn)該致病菌為豬葡萄球菌。為初步分析本試驗分離株葡萄球菌的致病性，以昆明小鼠為動物模型進行初步探究，結果發(fā)現(xiàn)該菌可導致小鼠出現(xiàn)較嚴重的臨床癥狀，如皮膚接種處有被毛脫落或潰瘍等，但未對小鼠致死，這在一定程度上說明該菌具有較低的致病性。

養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展在一定程度上得益于抗生素的使用，但這也導致豬場各種耐藥菌的產(chǎn)生。梁榮等[6]對廣東省豬源葡萄球菌耐藥性分析結果表明，1 485株豬源葡萄球菌對紅霉素、四環(huán)素、克林霉素、氟苯尼考等抗生素耐藥性嚴重，其耐藥率分別為91.0%、90.2%、84.6%和82.0%；岑靜等[7]研究發(fā)現(xiàn)，湖南地區(qū)分離的豬葡萄球菌對青霉素、慶大霉素、林可霉素和氟苯尼考等具有耐藥性。但本試驗分離的菌株對大部分被測抗生素十分敏感，如青霉素、氨芐西林和氟苯尼考等，僅對林可霉素耐藥。與該場負責人溝通得知該場平時較少使用抗生素，這可能是該場分離葡萄球菌對大部分常用抗生素敏感的主要原因。