豬流行性腹瀉病毒湖南分離株ORF3基因克隆與遺傳進化分析

廖 帆，楊雅娣，譚 磊

（湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙 410128）

豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是嚴重影響我國養豬業發展的腸道傳染病，由豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）引起，該病具有急性和高度接觸性等特點[1]。仔豬感染PEDV后可表現嚴重的臨床癥狀，如嘔吐、消瘦和持續性腹瀉等，并出現高死亡率。近來年，PED仍然是導致我國仔豬腹瀉的主要腸道病原之一，大部分豬場暴發PED由PEDV變異株感染所致，少數則由PEDV傳統株感染引起，使得目前我國PED的防控較為嚴峻[2]。由于發病仔豬在短時間內會出現死亡，對PED進行及時而準確的診斷對該病的防控極為重要，本次研究采用RT-PCR技術對某規模化豬場疑似感染PEDV的仔豬腸道組織進行病原診斷，并對PEDV毒株的ORF3基因序列進行擴增與分析，確定導致仔豬發病的PEDV毒株類型，為相應的防控措施制定提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 病料來源

12份樣品來源于湖南省某規模化豬場，該場于2018年9月初暴發腹瀉，樣品均為帶有腹瀉癥狀的仔豬腸道組織及其內容物。

1.2 試驗材料

Trizol Regent購買于美國賽默飛公司；反轉錄相關試劑購自于美國Promega公司；PCR試劑及DNA marker分別購自于長沙擎科生物有限公司和北京全式金生物有限公司；其它耗材購自于深圳華大基因股份有限公司；PCR儀購自于美國ABI公司；不同規格移液器和低溫冷凍離心機等購自于美國。參考文獻[3]合成ORF3基因擴增引物，引物由長沙擎科生物科技有限公司合成。

1.3 樣品的處理及組織RNA提取

取1.0 g左右組織樣品，剪碎，置于2.0 mL的離心管中，加入適量生理鹽水后勻漿，其后反復凍融3次，低溫高速（12 000 r/min）離心15 min，取上清液。采用Trizol法提取組織RNA，RNA樣品保存于-80 ℃。

1.4 PEDV ORF3基因PCR擴增、克隆與測序

用反轉錄試劑盒將RNA制備為cDNA，以cDNA為模板，PCR反應體系（50 μL）：上下游引物各2 μL、cDNA模板2 μL、2×easy taq mix 25 μL、無RNA酶水19 μL；反應條件為：94 ℃5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環，72 ℃ 5 min。將PCR產物于1%瓊脂糖進行凝膠電泳，在紫外線下觀察是否有目的條帶。將陽性樣品片段切膠，回收，連接至PUCM-T載體，將重組質粒進行PCR和雙酶切驗證，陽性克隆送長沙擎科生物科技有限公司測序。

1.5 序列分析

從NCBI中選取國內外具有代表性的PEDV分離株ORF3基因作為參考序列，應用DNAstar軟件對不同毒株核苷酸/氨基酸序列同源性進行分析，明確其基因變異情況，應用Mega 5.0軟件中NJ法構建不同毒株的種系遺傳進化樹。

2 結果

2.1 樣品RT-PCR檢測結果

對采自湖南省邵陽市某規模化豬場的12份樣本進行檢測，發現其中3份（1號、5號、7號）為PEDV陽性（圖1），其電泳結果顯示擴增的目的條帶與預期一致。

圖1 12份腸道組織PEDV病原檢測電泳

2.2 菌液PCR及質粒酶切驗證結果

將陽性PCR產物進行TA克隆后，將假定陽性菌落進行擴增，質粒提取后，使用內切酶（Ecor I和Not I）對樣品進行酶切，酶切驗證結果顯示質粒被切為2個片段，分別為載體（約2 700 bp）和目的基因片段（約750 bp），詳見圖2。

圖2 酶切驗證凝膠電泳

2.3 ORF3序列遺傳進化樹分析

3份陽性樣品分別標記為PEDV-1、PEDV-2和PEDV-3，將ORF3基因序列兩端多余序列切除，得到ORF3基因序列大小均為675 bp。將PEDV-1、PEDV-2和PEDV-3的ORF3基因序列進行比對發現，其序列無核苷酸缺失或插入的現象，僅出現個別核苷酸突變，3株PEDV分離株的ORF3基因序列的同源性為99.2%～100.0%，其中PEDV-1和PEDV-2分離株同源性為100.0%，3個分離株與PEDV變異株的同源性為98.8%～99.9%，但與PEDV CV777疫苗毒株同源性較低，為95.4%～96.3%。

進一步分析ORF3基因與國內外PEDV毒株的親緣關系，將所得的3條ORF3基因序列與從GenBank中下載的15株國內外PEDV ORF3序列進行遺傳進化樹構建，如圖3所示，發現本次研究獲得的PEDV毒株均與GenBank收錄的PEDV變異株聚為一個分支，與其它PEDV弱毒株或傳統毒株相隔較遠。

圖3 PEDV ORF3序列遺傳進化樹

3 討論

自2010年來，PEDV開始廣泛流行，從眾多的研究中不難發現，這是由于PEDV變異株出現導致的。在此之前，由于PEDV滅活疫苗及弱毒疫苗的廣泛且有效的接種，使PED的流行趨勢一度得到有效控制，但可能正是由于這些疫苗的長期廣泛的使用及外界環境等因素造成易感豬群免疫力下降，且在此期間發生了基因變異現象，從而出現了PEDV變異株。其次，PEDV 屬于RNA病毒，由于RNA聚合酶缺乏修正功能，這無疑加大了PEDV在復制過程中發生變異的幾率[4]。

檢測PEDV病原的技術有很多種，本試驗采用RT-PCR法對采得樣品中PEDV病原進行檢測。通過對發病豬場收集的樣品進行PEDV病原檢測發現，12份被檢測樣品中有3份檢測為PEDV陽性，其陽性率為25.0%，由此推斷該豬場仔豬腹瀉可能由PEDV感染所引起。

ORF3基因編碼PEDV唯一輔助蛋白，與病毒的毒力強弱有關，其編碼產物為離子通道蛋白，能調控病毒在宿主細胞內的增殖[5]。陳如敬等[6]通過對PEDV FJ-11A分離株ORF3基因與國內外PEDV參考毒株的序列分析發現，可以根據ORF3基因序列特征區分野毒株與疫苗株、弱毒株；進一步建立的系統進化樹可見PEDV在遺傳進化上主要呈現兩個分支，其中PEDV疫苗株和弱毒株聚為一個分支，而PEDV變異株位于另一分支上，兩者相聚較遠。在本研究中，通過對該豬場3個PEDV陽性樣品的ORF3基因序列進行擴增、測序與分析發現，3個PEDV分離株ORF3基因片段大小均為675 bp，其核苷酸同源性為99.2%～100.0%，與PEDV變異株的同源性為98.8%～99.9%，但與PEDV CV777毒株同源性較低，為95.4%～96.3%；系統種系發育樹結果顯示本次研究獲得的PEDV分離株均與PEDV變異株聚為一個分支，與PEDV弱毒疫苗或傳統毒株所屬分支相隔較遠，提示該豬場暴發的PEDV毒株可能為變異株，因此針對PEDV變異株發生與流行的防控措施需要制定與緊急實施。