豬丁型冠狀病毒的分離鑒定

陳奕帆，邱文英，張麗燕，孫繼海，郝偉偉，嚴應海

（1.華派生物工程集團有限公司，四川 成都 641402；2.簡陽市十里壩街道辦事處社區事務服務中心，四川 簡陽 641400）

PDCoV（豬丁型冠狀病毒）屬于套式病毒目、冠狀病毒科、δ冠狀病毒屬，是近年來發現的一種新型豬腸道病病原。PDCoV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組長約25.4 kb，其構成和排列順序為5'UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-N-3'UTR[1-2]。其中，S基因編碼的S蛋白含有1 159或1 160個氨基酸殘基，以三聚體形式聚集于病毒囊膜的表面，主要參與病毒與宿主細胞的吸附和融合，同時也是誘導機體產生中和抗體的主要抗原蛋白[3-4]。最早于2012年由Woo等從中國香港收集的豬糞便拭子中檢測到，隨后國內研究學者賀東生等從嚴重腹瀉的新生仔豬小腸病料中檢測到PDCoV，且有證據顯示2004年前國內不同地區的豬群中已存在PDCoV[2，5-6]。PDCoV可感染各種年齡段的豬群，但對新生仔豬的危害最大，感染率最高，引起的死亡率約為30%～40%[7]。感染仔豬臨床表現為水樣腹瀉、嘔吐、脫水，剖檢病理結果顯示腸壁變薄，變透明，腸內充斥著大量黃色液體，組織病理學變化主要見于空腸中、遠端和回腸，十二指腸和空腸近端的病變不明顯，病變主要表現為腸絨毛上皮細胞萎縮、壞死，同時退化的腸上皮細胞進入管腔[8]。PDCoV導致的臨床癥狀和病理學變化與豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）或豬傳染性胃腸炎（Transmissible Gastroenteritis,TGE）相似，且常伴隨混合感染的情況，對于PDCoV的鑒別診斷需要借助實驗室手段。

本研究利用特異性的RT-PCR方法對收集的6份病料進行檢測，對確認為PDCoV 陽性的病料進行病毒的分離，并通過CPE、RT-PCR及S基因序列測定分析對分離的病毒進行鑒定，旨在為進一步開展PDCoV生物學特性研究和疫苗研制奠定基礎。

1 材料

1.1 病料及細胞

華派生物工程集團有限公司2016年從四川某豬場采集到6份腹瀉仔豬小腸及內容物樣本。豬睪丸（ST）細胞由華派生物工程集團有限公司保管及供應。

1.2 主要試劑

TRIzol?LS Reagent購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；高效率逆轉錄試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；MEM培養基購自GIBCO；新生牛血清購自內蒙古金源康生物工程材料有限公司；PEDV、TGEV、PRoV（輪狀病毒）和PDCoV的特異性引物由華派生物工程研發中心實驗室保存。

2 方法

2.1 病料的檢測

2.1.1 臨床病料處理 取少量小腸組織及內容物置于1.5 mL離心管，加入適量的PBS，經組織勻漿機勻漿處理制成20%（1∶5的重量體積比）組織懸液，反復凍融3次，離心收集上清液。

2.1.2 病料的RT-PCR檢測 參照TRIzol?LS Reagent試劑說明書提取病毒的基因組RNA，以提取的總RNA為模板，利用cDNA反轉錄試劑盒合成病毒cDNA。以cDNA為模板，配制PCR擴增體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 3 μL，ddH2O 7.5 μL。反應程序為95 ℃，5 min；95 ℃，45 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min；30個循環；72 ℃，10 min。反應結束后，對PCR產物進行核酸電泳分析。

2.2 PDCoV-SCMS株的分離與鑒定

2.2.1 PDCoV陽性病料處理 取RT-PCR鑒定為PDCoV 陽性的小腸組織及內容物，加入滅菌的PBS研磨，制成20%（1∶5的重量體積比）組織懸液，反復凍融3次后離心收集上清液，上清液用0.22 μm濾器過濾除菌。

2.2.2 PDCoV病毒的分離與傳代培養 取長成單層的ST細胞，倒掉細胞生長培養液，用PBS洗滌，加入過濾的上清液1.0 mL，置37 ℃吸附作用1 h后棄掉多余液體，加入含5 μg/mL胰酶的MEM維持液，置37 ℃、5% CO2培養箱培養。之后逐日觀察細胞是否出現病變，無病變則在培養120 h后收獲，繼續進行盲傳，直到出現明顯的細胞病變，產生明顯病變的細胞收獲物在ST細胞上連續傳代，當細胞病變穩定后進行病毒蝕斑純化。重復進行兩次蝕斑純化，保存病毒種子并記為F1代，在ST細胞中繼續傳代培養。

2.2.3 分離毒株的RT-PCR鑒定 根據2.1.2中操作方法，對蝕斑純化株F4代進行RT-PCR檢測。

2.3 分離毒株的滴度測定

將分離毒株F5、F10、F15和F20代病毒液用含5 μg/mL胰酶的MEM維持液進行10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-74個稀釋度病毒液，接種于長滿單層ST細胞的96孔細胞培養板中，每個滴度接種8孔，每孔接種100 μL，同時設正常細胞對照，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養72～96 h，觀察細胞病變。

2.4 分離毒株的S基因序列測定

參考GenBank上收錄的豬丁型冠狀病毒基因序列（登錄號：MH715491.1），利用軟件針對S基因保守區域設計4對特異性引物。引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

參照TRIzol?LS Reagent試劑說明書提取F2代病毒的RNA，并利用cDNA反轉錄試劑盒合成病毒cDNA。以cDNA為模板，配制PCR擴增體系：2×PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應程序為95 ℃，5 min；95 ℃，45 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1.5 min；30個循環；72 ℃，10 min。反應結束后，將PCR產物送生物公司進行序列測定。

2.5 分離毒株的S基因序列分析

運用 DNA Star 軟件中的 SeqMan 對擴增的 4個基因片段測序結果進行剪切拼接，獲得 SCMS株的S基因序列，再利用MegAlign將SCMS株的S基因序列與 GenBank 收錄的PDCoV參考毒株（表2）S基因序列進行比對分析。

表2 參考毒株信息

3 結果

3.1 病料的檢測結果

利用實驗室已有的 PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV 特異性引物對2016年四川某豬場腹瀉仔豬病料進行 RT-PCR 檢測，檢出6號病料為單一感染PDCoV的陽性病料（圖1）。

圖1 6號病料RT-PCR擴增結果

3.2 病毒的分離鑒定結果

3.2.1 病毒的分離 將處理后的6號病料上清液接種ST細胞，在盲傳至第5代時出現明顯細胞病變，在傳至第8代后出現了較規律穩定的細胞病變，主要表現為細胞變大、變圓，繼而細胞融合、脫落。第10代病毒接種ST細胞后60 h開始出現蝕斑，隨時間增加蝕斑開始逐步變大，挑取直徑為1.0～2.0 mm、清亮的蝕斑，經2次純化，所有蝕斑直徑大小基本一致。

3.2.2 分離毒株的RT-PCR鑒定結果 將蝕斑純化株F5代細胞毒進行RT-PCR鑒定，擴增出一條約865 bp的特異性目的條帶（圖2），表明試驗成功從6號病料中分離到一株PDCoV，命名為PDCoVSCMS。

圖2 RT-PCR鑒定結果

3.2.3 TCID50的測定 分離株PDCoV-SCMS在ST細胞上連續傳代，測定F5、F10、F15及F20代細胞毒的TCID50，培養72 h，觀察細胞病變情況。按Reed-Muench法計算TCID50，具體結果見表3。PDCoV-SCMS在ST細胞上連續傳代，病毒滴度較穩定。

表3 TCID50測定結果

3.3 S基因序列同源性分析

分離株PDCoV-SCMS的S基因包含3 480個核苷酸，與23個參考毒株之間的同源性為95.9%～98.5%，詳見圖3。PDCoV-SCMS分離株的S基因與美國、韓國、墨西哥分離毒株的同源性為96.8%～97.8%；與中國其他分離毒株的核苷酸同源性為97.1%～98.5%，其中與2018年山東分離株SD-11-2018同源性最高為98.5%；而與越南、泰國分離毒株的同源性最低，為95.9%～96.7%。

圖3 SCMS分離毒株與參考毒株S基因序列同源性比對

4 討論

自2012年Woo等首次從香港豬群中檢測到PDCoV以后，在美國、加拿大、墨西哥、韓國、泰國、越南等國家相繼出現了豬群感染PDCoV的報道[9-12]。2014年，在美國俄亥俄州PDCoV造成30%～40%仔豬死亡[13]。2015年，PDCoV在泰國某商品化豬場造成了母豬27.63%（829/3 000）的死亡率和仔豬64.27%（2 892/4 500）的死亡率[11]。同年7月，我國華南某規模化豬場5～15日齡仔豬發生大規模嚴重腹瀉，發病率90%，造成的死淘率在90%以上，后經RT-PCR鑒定均為PDCoV陽性[5]。PDCoV在世界各地的相繼暴發，給養豬業造成了巨大的經濟損失。通過一些流行病學調查發現，PDCoV在我國大陸的流行已較為普遍，且我國近年來感染率呈上升趨勢[15-17]。

豬腎小管上皮細胞（LLC-PK）、豬腎細胞（PK-15）及ST細胞是常用于PDCoV分離的細胞系，因此本試驗利用ST細胞分離PDCoV。試驗結果顯示，從四川某豬場PDCoV陽性病料中成功分離到一株PDCoV，將該病毒株命名為PDCoV-SCMS株。PDCoV-SCMS毒株能在ST細胞上穩定增殖，形成典型的細胞病變，病毒滴度也較穩定，S基因序列同源性分析顯示PDCoV-SCMS株與山東分離株SD-11-2018同源性最高為98.5%，與越南、泰國分離毒株的同源性最低。