LncRNA SLC16A1-AS1通過靶向miR-15a-5p負向調控子宮頸癌細胞的增殖和侵襲

盧 豪，占穩穩，熊國平，吳汝芳，胡曉繼，韓迎燕，李 莉，張慶華

子宮頸癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，其發病年齡逐漸呈年輕化，嚴重威脅女性的生命健康[1]。子宮頸癌的發病涉及遺傳、病毒感染等多種因素，盡管子宮頸癌的治療已取得較大進展，子宮頸癌細胞的高增殖性和侵襲性嚴重影響患者的預后[2-3]。近年隨著分子生物學的發展，分子靶向治療成為子宮頸癌分析的熱點。文獻報道，異常表達的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)參與子宮頸癌的發生、發展[4]。LncRNA是通過調控其靶基因的表達，影響細胞的分化、增殖、侵襲、凋亡、衰老等生物學過程[5-6]。研究顯示，LncRNA SLC16A1-AS1在肺癌、肝癌等腫瘤組織中表達降低，過表達SLC16A1-AS1可明顯抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲[7]。目前，SLC16A1-AS1在子宮頸癌組織中的表達及其對子宮頸癌細胞增殖和侵襲的影響尚不明確。本實驗著重探討SLC16A1-AS1在子宮頸癌組織和細胞株中的表達，分析其靶向miR-15a-5p與子宮頸癌細胞增殖和侵襲的關系，為臨床子宮頸癌的靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集2018年3月～2020年8月華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院婦產科33例子宮頸癌根治術標本，患者年齡41～69歲，平均(49.31±7.87)歲。根據國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecologyand Obstetrics, FIGO)分期：I期12例，Ⅱ期10例，Ⅲ期11例；組織分化程度：低分化14例，中分化19例?；颊咝g前均未接受放、化療或生物治療。新鮮組織標本儲存于液氮罐中。另選同期因子宮肌瘤行全子宮切除標本，并經病理證實無子宮頸病變者作為對照。本實驗經我院倫理委員會批準，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 細胞及試劑人正常子宮頸上皮細胞H8和子宮頸癌細胞株HeLa、HCC94、SiHa、C33A，均購自中國科學院上海細胞庫。陰性質粒(NC)、SLC16A1-AS1過表達質粒、miR-NC、miR-15a-5p模擬物、SLC16A1-AS1野生型質粒(SLC16A1-AS1-WT)、SLC16A1-AS1突變體質粒(SLC16A1-AS1-MUT)，均購自廣州銳博生物公司。DMEM培養基、RPMI-1640培養基、胎牛血清，均購自美國Gibco公司。qRT-PCR試劑盒購自日本Takara公司。MTT試劑盒購自北京博奧拓達科技公司。qRT-PCR引物由上海生物公司合成。Lipofectamine 3000、Matrigel基質膠，均購自美國Invitrogen公司。Transwell小室購自美國Corning公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，購自上海碧云天生物公司。GAPDH、PCNA、N-cadherin、Slug、Ki-67蛋白抗體，均購自英國Abcam公司(蛋白編號分別為ab8245、ab29、ab76011、ab27568、ab16667)。

1.3 細胞培養與轉染HeLa、HCC94、SiHa細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基，H8、C33A細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。在24孔板中培養C33A細胞至對數生長期，采用Lipofectamine 3000試劑將NC、SLC16A1-AS1過表達質粒分別轉染至C33A細胞，標記為NC組和SLC16A1-AS1組。轉染8 h后，更換新鮮培養基。

1.4 qRT-PCR檢測SLC16A1-AS1和miR-15a-5p表達在不同子宮頸組織或細胞中加入Trizol裂解液，提取總RNA后逆轉錄為cDNA。以GAPDH、U6為SLC16A1-AS1和miR-15a-5p的內參基因，配制20 μL的qRT-PCR反應體系，上、下游引物各1 μL(表1)。以2-ΔΔCt法分析計算SLC16A1-AS1和miR-15a-5p的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 MTT法檢測C33A細胞的增殖胰酶消化NC組和SLC16A1-AS1組C33A，以每孔200 μL接種至96孔板，每孔2×103個細胞，每組3個復孔。在接種后第24、48、72、96、120 h分別加入MTT試劑20 μL，培養3 h。每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩器震蕩15 min。采用酶標儀檢測C33A細胞在490 nm波長處的吸光度(A)值。

1.6 Transwell實驗檢測C33A細胞的侵襲能力將Matrigel基質膠與無血清RPMI-1640培養基按1 ∶2混勻，置于Transwell小室上室。胰酶消化NC組和SLC16A1-AS1組C33A細胞，使用無血清RPMI-1640培養基重懸以每孔200 μL接種至Transwell小室上室；每孔2×104個細胞，每組3個復孔。下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，培養24 h。棄去培養基，用棉簽擦去未穿過細胞，多聚甲醛固定，結晶紫染色。采用流水清洗并晾干，在100倍顯微鏡下進行觀察，計數穿膜細胞數。

1.7 生物信息學技術預測及雙熒光素酶報告基因實驗驗證SLC16A1-AS1的靶基因采用生物信息學網站starBase v2.0，預測SLC16A1-AS1可能的靶向miRNA。接種對數生長期的C33A細胞至24孔板，分別共轉染SLC16A1-AS1-WT+miR-NC、SLC16A1-AS1-WT+miR-15a-5p、SLC16A1-AS1-MUT+miR-NC和SLC16A1-AS1-MUT+miR-15a-5p。轉染48 h后，根據雙熒光素酶報告基因實驗試劑盒說明書，檢測各組C33A細胞的相對熒光酶活性。

1.8 Western blot法檢測蛋白表達采用細胞裂解液提取NC組和SLC16A1-AS1組C33A細胞總蛋白，每組按40 μg上樣量進行聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)電泳(110 V恒壓)，轉膜至聚偏二氟乙烯膜(200 mA恒流)，在5%脫脂牛奶中封閉3 h。一抗均按1 ∶2 000比例稀釋，聚偏二氟乙烯膜在冰箱內一抗孵育過夜。二抗均按1 ∶5 000比例稀釋，聚偏二氟乙烯膜在室溫二抗孵育1.5 h。滴加電化學發光顯影液進行顯影，在凝膠成像儀中顯影并采集圖片，用GADPH作為內參。

2 結果

2.1 子宮頸癌和癌旁組織中SLC16A1-AS1的表達qRT-PCR結果顯示，子宮頸癌組織和癌旁組織中SLC16A1-AS1的表達水平分別為1.63±0.31和7.35±0.48，差異有統計學意義(P<0.01，圖1)。

圖1 子宮頸癌組織和癌旁組織中SLC16A1-AS1的表達水平：與癌旁組織相比，**P<0.01

2.2 子宮頸癌細胞株和正常子宮頸上皮細胞中SLC16A1-AS1表達水平qRT-PCR結果顯示，與正常子宮頸上皮細胞H8相比，子宮頸癌細胞株HeLa、HCC94、SiHa、C33A中SLC16A1-AS1的表達水平下降，差異均有統計學意義(P<0.05，圖2)。本組選擇表達水平最低的C33A細胞進行后續實驗。

圖2 子宮頸癌細胞株和正常子宮頸上皮細胞中SLC16A1-AS1的表達水平：與H8細胞相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 SLC16A1-AS1質粒轉染效率驗證NC組和SLC16A1-AS1組的C33A細胞中，SLC16A1-AS1表達水平分別為1.06±0.19和9.92±1.04。與NC組相比，SLC16A1-AS1組的C33A細胞中SLC16A1-AS1的表達明顯增加(P<0.01)。

2.4 過表達SLC16A1-AS1對C33A細胞增殖能力的影響MTT結果顯示，與NC組相比，SLC16A1-AS1組中C33A細胞的吸光度(A)值24 h后下降，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。本組結果提示過表達SLC16A1-AS1能抑制C33A細胞的增殖能力。

圖3 過表達SLC16A1-AS1對C33A細胞增殖的影響：與NC組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.5 過表達SLC16A1-AS1對C33A細胞侵襲能力的影響Transwell實驗結果顯示，NC組和SLC16A1-AS1組中C33A細胞的侵襲細胞數分別為(107.10±13.17)個和(41.76±11.12)個，差異有統計學意義(P<0.01，圖4)。本組結果提示過表達SLC16A1-AS1可抑制C33A細胞的侵襲能力。

圖4 過表達SLC16A1-AS1對C33A細胞侵襲的影響：A.Transwell侵襲圖；B.細胞侵襲數統計柱狀圖，與NC組相比，**P<0.01

2.6 SLC16A1-AS1靶向結合miR-15a-5pstarBase v2.0預測網站顯示：SLC16A1-AS1可能的靶基因是miR-15a-5p(圖5)。雙熒光素酶報告基因實驗顯示：與SLC16A1-AS1-WT+miR-NC組相比，miR-15a-5p可明顯下調SLC16A1-AS1-WT質粒的相對熒光素酶活性(P<0.01)。對特異性結合區域點突變后，與SLC16A1-AS1-MUT+miR-NC組相比，miR-15a-5p不能抑制SLC16A1-AS1-MUT質粒的相對熒光素酶活性(P>0.05，圖6)，提示SLC16A1-AS1可與miR-15a-5p特異性結合。

圖5 SLC16A1-AS1與miR-15a-5p結合預測圖

圖6 雙熒光素酶報告基因實驗驗證SLC16A1-AS1靶向結合miR-15a-5p：與SLC16A1-AS1-WT+miR-NC組相比，**P<0.01

2.7 各組C33A細胞中miR-15a-5p的表達NC組和SLC16A1-AS1組中C33A細胞的miR-15a-5p表達水平分別為1.02±0.06和0.19±0.04。與NC組相比，SLC16A1-AS1組C33A細胞中miR-15a-5p的表達明顯降低(P<0.01)，提示SLC16A1-AS1可靶向抑制miR-15a-5p的表達。

2.8 過表達SLC16A1-AS1對增殖和侵襲相關蛋白的影響Western blot結果顯示：與NC組相比，轉染SLC16A1-AS1后，C33A細胞的增殖表型蛋白如PCNA、Ki-67表達降低，C33A細胞的侵襲表型蛋白如N-cadherin、Slug表達降低(圖7)。

圖7 Western blot法檢測SLC16A1-AS1對增殖和侵襲相關表型蛋白表達的影響

3 討論

LncRNA屬于內源性非編碼RNA，經RNA聚合酶Ⅱ轉錄合成[8-11]。LncRNA雖然不具有編碼蛋白質的生物學功能，其可通過影響靶基因的表達，參與調控腫瘤細胞的多種生物學過程[12-17]。 研究證實，LncRNA如MIR22HG、LINC01305、EWSAT1被發現在子宮頸癌組織中表達明顯異常，與子宮頸癌患者的放療敏感性、預后等密切相關[18-21]。Liu等[7]報道SLC16A1-AS1在非小細胞肺癌組織和細胞株中明顯下調，過表達SLC16A1-AS1可抑制肺癌細胞的活力并促進細胞凋亡；SLC16A1-AS1表達水平較高的患者總生存期和無進展生存期更長。Pei等[22]報道SLC16A1-AS1在肝癌組織和細胞中明顯下調，SLC16A1-AS1過表達抑制肝癌細胞的增殖和侵襲，增強肝癌細胞的放療敏感性。SLC16A1-AS1表現為明顯的抑癌基因作用。本實驗結果顯示，子宮頸癌組織中SLC16A1-AS1的表達水平低于子宮頸正常組織，子宮頸癌細胞株中SLC16A1-AS1的表達水平低于正常子宮頸上皮細胞，提示其可能參與調控子宮頸癌的發生、發展。本實驗進一步篩選SLC16A1-AS1表達最低的C33A細胞進行后續實驗，過表達SLC16A1-AS1后，C33A細胞的增殖和侵襲能力均明顯降低，提示SLC16A1-AS1在子宮頸癌中可能發揮抑癌基因作用。

LncRNA屬于線性RNA，可通過海綿吸附作用結合miRNA，有效抑制miRNA的表達[23-27]。生物信息學技術預測顯示，SLC16A1-AS1與miR-15a-5p有特異性結合位點，miR-15a-5p可能是SLC16A1-AS1的靶基因。雙熒光素酶報告基因實驗證實，miR-15a-5p是SLC16A1-AS1的靶基因。miR-15a-5p屬于miR-15a家族的一員，在胃癌、卵巢癌、腎癌等組織中表達上調，可促進腫瘤細胞的惡性生物學行為，發揮癌基因的作用[28-29]。miR-15a-5p在子宮頸癌組織和細胞株中均呈高表達，抑制miR-15a-5p表達可顯著降低子宮頸癌細胞的增殖和侵襲[30]。本實驗通過qRT-PCR檢測發現，SLC16A1-AS1可負向調控miR-15a-5p的表達。以上結果表明，SLC16A1-AS1通過下調miR-15a-5p的表達，抑制子宮頸癌C33A細胞的增殖和侵襲。Western blot結果顯示，SLC16A1-AS1降低miR-15a-5p表達后，C33A細胞的增殖表型蛋白如PCNA、Ki-67表達降低，C33A細胞的侵襲表型蛋白如N-cadherin、Slug表達降低，間接表明子宮頸癌C33A細胞的增殖和侵襲能力下降。

綜上所述，SLC16A1-AS1在子宮頸癌組織及細胞株中低表達，SLC16A1-AS1可通過靶向負調控miR-15a-5p表達，抑制子宮頸癌C33A細胞的增殖和侵襲能力。SLC16A1-AS有望成為子宮頸癌治療的靶點。