miR-132在消化系統惡性腫瘤中的研究進展

秦 雯，朱小東

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類內源性、單鏈、短而高度保守的非編碼RNA，其長度僅為18～24個核苷酸，可調節其靶向信使RNA(messenger RNA, mRNA)的穩定性或翻譯效率。研究表明，miRNA參與細胞的增殖、分化、轉移和凋亡等各種生物過程，并常作為癌基因或抑癌基因，在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。因此，miRNA被認為是各種惡性腫瘤治療的潛在新靶點。本文圍繞miRNA中與消化系統惡性腫瘤關系較密切的miR-132，從其結構、功能、檢測方法及與消化系統惡性腫瘤之間的關系等方面作一綜述。

1 miR-132的概述

1.1 miR-132的位置及結構miR-132定位于人第17號染色體，是發現較早的miRNA之一。成熟的miR-132長度為22 bp，由前體序列(長度為66 bp)加工而成。人體內含有兩種同源miR-132，即hsa-miR-132-5p和hsa-miR-132-3p[1]。

1.2 miR-132的基本功能大量研究表明，miR-132通過基因表達調控網絡在心血管疾病、神經系統疾病和惡性腫瘤等病理過程中起關鍵調節作用。在心血管疾病中，miR-132參與靜態內皮細胞活化、增殖、遷移及毛細血管形成；在神經系統疾病中，miR-132通過作用于乙酰膽堿酯酶發揮調節作用[1]；在許多惡性腫瘤中，miR-132通過發揮致癌基因或抑癌基因作用，參與腫瘤的發生，并在腫瘤細胞轉移和集落形成中發揮重要作用。文獻報道，肺癌[1]、前列腺癌[2]、乳腺癌[3]、子宮頸癌[4]、口腔鱗狀細胞癌[4]、甲狀腺癌[5]、套細胞淋巴瘤[6]以及消化系統惡性腫瘤[7-8]等均與miR-132關系密切，其中消化系統惡性腫瘤與miR-132的關系特別密切。

1.3 miR-132的檢測方法目前，已有包括RNA測序、芯片和實時定量逆轉錄PCR(quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR)等多種方法用于檢測種類繁多的miRNA[9-10]。測序法和芯片法的優勢在于發現新的miRNA及尋找與疾病相關的差異表達miRNA，適合高通量的miRNA分析，但不適合常規使用。RT-qPCR是檢測的金標準，它先將成熟的miRNA轉化成cDNA序列，然后利用qPCR進行擴增。qPCR技術的靈敏度、特異性和重復性均較好，但整個過程中最易出錯的步驟是逆轉錄反應。近年又涌現一些檢測miRNA的新方法：(1)SplintR-qPCR法，保留了qPCR檢測過程，但改變了cDNA合成過程。該方法利用SplintR連接酶將與miRNA互補的探針A和探針B相連接，以取代逆轉錄過程。(2)免疫分析的miRNA定量法——miREIA，該方案是利用DNA探針與miRNA靶點進行雜交，然后再利用獨特的單克隆抗體對DNA/RNA雜交體進行定量。其檢測原理與ELISA相似，可使用常規ELISA設備，便于臨床實驗室開展檢測[11]。

2 miR-132與消化系統惡性腫瘤的關系及意義

miR-132作為抑癌基因或癌基因，通過調控眾多靶基因的翻譯和轉錄，參與消化系統惡性腫瘤的發生、發展。因此，深入分析miR-132與消化系統惡性腫瘤的關系，了解miR-132基因表達和在不同消化系統惡性腫瘤調控網絡中的地位、作用，將為診斷、治療和預后提供新思路和強有力的干預策略，具有重要的運用價值。

2.1 miR-132與肝癌的關系miR-132主要通過Hippo、Hedgehog和AKT/mTOR等信號通路在肝癌中發揮作用：(1)Hippo信號通路由一組保守的激酶構成，該通路可抑制細胞的生長和增殖。當胞外環境的生長抑制信號被Hippo信號通路上游的膜蛋白受體俘獲后，就會誘發一系列激酶的磷酸化反應，最終作用于Yes相關蛋白(Yes-associated protein, YAP)[12]和轉錄共激活子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif, TAZ)等下游效應因子。YAP在促進細胞的增殖和惡性轉化、抑制凋亡和導致細胞喪失接觸抑制等過程中發揮重要作用。Lei等[13]研究發現，YAP在肝細胞癌中為致癌基因。miR-132可通過Hippo信號通路靶向YAP，使其下調并抑制肝癌細胞的增殖。(2)Hedgehog信號通路是一條高度保守的信號通路，其異常激活在胚胎期會導致多種嚴重的生長缺陷，而在成年期則可導致腫瘤的發生。在肝細胞癌中，miR-132通過與牛磺酸上調基因1(taurine upregulated gene 1, TUG1)競爭結合音猬因子(sonic hedgehog protein, SHH)，從而抑制Hedgehog信號通路的激活，并使肝癌細胞的增殖受抑制[14]。(3)mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在蛋白組成和分子靶點不同的各種信號復合物中mTOR是核心成分。mTOR在進化上高度保守，可以感知和整合細胞內外多種信號，與凋亡、自噬、存活、轉錄、分化、能量代謝等許多細胞進程相關，在多種腫瘤中常過度激活[15]。同時mTOR也受與其交叉的正、負調節因子所在信號通路的影響，如磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)和AKT[16]組成的PI3K/AKT信號通路。AKT/mTOR信號通路的作用之一是調控自噬。在生長過快、能量缺乏的腫瘤組織中，可以通過激活AKT/mTOR信號通路而調控自噬，減少毒性產物的積累，從而維持腫瘤細胞的存活。miR-132可靶向磷酸肌醇-3-激酶調節亞基3(phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 3, PIK3R3)，從而調控AKT/mTOR信號通路。通過對肝癌組織及肝癌細胞株的研究發現，miR-132下調并激活AKT/mTOR信號通路，使自噬水平上調，同時靶向上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關受體，從而與腫瘤分化、轉移、TNM分期呈負相關。miR-132可能通過Hippo信號通路和Hedgehog信號通路抑制肝癌細胞的增殖，也可能通過AKT/mTOR信號通路抑制肝癌的轉移和EMT，在肝癌中充當抑癌基因的角色。

2.2 miR-132與胰腺癌的關系目前，miR-132與胰腺癌的關系尚存爭議。大多數研究認為，miR-132在胰腺癌中為癌基因[8,17]；少數研究則認為，miR-132在胰腺癌中為抑癌基因[18]。

2.2.1miR-132與胰腺癌細胞增殖的關系 miR-132對胰腺癌細胞增殖的影響主要涉及Hedgehog信號通路、腫瘤抑制基因Rb1和AKT信號通路。(1)Hedgehog信號通路：Hedgehog蛋白屬于前體蛋白，它能自動催化、裂解并黏附于細胞表面。Hedgehog信號通路由Hedgehog配體(即Shh、Dhh、Ihh)、膜蛋白、轉錄因子(即Gli1、Gli2、Gli3)和靶基因構成。其中Shh的激活可導致Myc、Ptch和Cyclin D的上調，從而促進腫瘤細胞的分化。因此，Hedgehog信號通路的激活以及靶基因的持續激活與許多惡性腫瘤的發生、發展密切相關。Zhao等[8]研究發現miR-132包含1個與Shh的3′UTR互補序列，可與之結合導致Shh的mRNA降解或翻譯抑制。miR-132上調可顯著抑制Shh的表達，最終通過Hedgehog信號通路促進胰腺癌細胞的增殖和抑制胰腺癌細胞的凋亡。(2)Rb1信號通路：Park等在胰腺癌組織和癌旁組織的分析中發現，pRb蛋白(腫瘤抑制基因Rb1的產物)在胰腺癌組織中表達下調。進一步研究表明，miR-132表達增加使pRb蛋白下調，促進胰腺癌的發生。pRb蛋白與E2F家族的隔絕轉錄因子關系密切。miR-132過表達引起的pRb蛋白下調導致E2F家族的去隔離，從而引起細胞周期相關基因(如細胞周期蛋白A1、A2、B1和E2)等轉錄目標的表達增加。此外，小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)引起的Rb1基因敲除也可增加細胞周期相關基因的表達。因此，pRb蛋白可以影響細胞周期G1/S和G2/M的轉變，并且其主要作用是引起G1期的停滯，最終導致胰腺癌細胞的不斷增殖。(3)AKT信號通路：Zhang等[18]發現miR-132過表達可導致AKT磷酸化減少和Cyclin D1表達減少，表明miR-132可能通過AKT信號通路的失活發揮其腫瘤抑制功能。因此，miR-132與胰腺癌細胞增殖的關系尚存在爭議。miR-132可能通過Hedgehog信號通路或下調腫瘤抑制基因Rb1促進胰腺癌細胞的增殖，也可能通過AKT信號通路抑制胰腺癌細胞的增殖。

2.2.2miR-132與胰腺癌轉移和EMT的關系 磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog, PTEN)屬于腫瘤抑制蛋白[20]。Zhang等[21]研究發現，在胰腺癌中miR-132上調、PTEN下調，兩者與胰腺癌腫瘤大小、TNM分期密切相關。miR-132在胰腺癌的發生、發展中起癌基因作用：當miR-132過表達時，與其直接靶基因PTEN基因3′UTR的一段保守序列結合，抑制并下調PTEN，促進胰腺癌細胞的浸潤和轉移；同時，PTEN也是EMT的重要調控因子。上述研究表明，miR-132可能通過靶向PTEN基因促進胰腺癌的轉移和EMT。

2.3 miR-132與胃癌的關系目前，miR-132與胃癌的關系也存在爭議。在一些研究中，miR-132促進胃癌細胞的增殖和化療耐藥；而在另一些研究中，miR-132抑制胃癌細胞的轉移。

2.3.1miR-132與胃癌細胞增殖的關系 “叉頭”(forkhead box protein, Fox)的命名來源于果蠅的“叉頭”基因，哺乳動物的叉頭蛋白O1(forkhead box protein O1, FoxO1)是一種重要的轉錄因子。FoxO1的功能受磷酸化、乙酰化和泛素化等翻譯后修飾的調節，同時也受與其結合的蛋白質調控。作為一種細胞周期抑制因子，其主要參與的生物學過程：細胞凋亡、DNA損傷修復、腫瘤發生和糖代謝等。Li等[22]通過熒光素酶報告基因檢測實驗證實miR-132與FoxO1 mRNA的3′UTR結合以阻礙其轉錄，從而降低FoxO1的表達水平。體外、體內實驗都進一步證實，FoxO1表達降低促進胃癌細胞的增殖，提示miR-132/FoxO1軸對胃癌細胞增殖的調控不依賴于微環境。

2.3.2miR-132與胃癌轉移及EMT的關系 Liu等[23]研究發現：(1)與正常組織相比，miR-132在胃癌組織中的表達明顯降低；(2)與原位癌相比，已發生肝轉移的胃癌組織中miR-132的表達水平更低；(3)miR-132表達水平與患者年齡、腫瘤大小、組織學類型、浸潤深度、血管侵犯、血道轉移、病理分級、5年生存率等密切相關；(4)miR-132對胃癌的影響主要通過PAK1/ATF2/miR-132軸實現。PAK家族是一組能轉化細胞表面信號，并調節胞質和胞核重要功能的激酶。它們參與細胞的增殖、運動、凋亡和EMT等多種生物學過程，與腫瘤的進展密切相關。其成員均具有N端調節區域及C端高度保守的激酶結構。根據N端調節區域中的GTP酶結合域有無自抑制區域，可將PAK家族成員分為Ⅰ和Ⅱ兩組，而PAK1屬于第一組，為絲氨酸/蘇氨酸激酶，是潛在的癌基因[24]。ATF2是與細胞生長、存活相關的重要轉錄因子，其通過在細胞中的不同定位，在調控腫瘤細胞基因轉錄的過程中發揮不同作用：當ATF2定位于細胞核時，與致癌作用有關；當ATF2定位于細胞質時，與抑癌作用有關[25]。PAK1通過使ATF2的Ser62殘基磷酸化并阻止其進入細胞核，從而調控ATF2的轉錄活性。隨后，ATF2通過與miR-132啟動子的-30至-39區域結合，進一步調控miR-132的轉錄。最終，通過PAK1/ATF2/miR-132軸進行的級聯反應增加miR-132的表達，抑制胃癌的血行轉移及EMT。

2.3.3miR-132與胃癌耐藥的關系 研究表明，腫瘤的化療耐藥部分源于一種具有耐藥性的腫瘤細胞亞群，該腫瘤細胞亞群也叫做腫瘤干細胞樣細胞(cancer stem cell-like cells, CSC)。CSC常導致腫瘤治療后復發，具有高度的致瘤性和耐藥性。Zhang等[26]研究發現，在Lgr5+胃癌CSC中miR-132表達上調，在體外和體內實驗中均證實miR-132上調可增加Lgr5+胃癌干細胞樣細胞(gastric cancer stem cell-like cells，GCSC)對順鉑的耐藥性。

2.4 miR-132與結腸癌的關系

2.4.1miR-132與結腸癌細胞增殖、轉移和EMT的關系 在結腸癌組織中，miR-132的表達水平降低，且其表達與腫瘤大小、TNM分期、遠隔轉移和預后密切相關。當miR-132高表達時，可抑制EMT和浸潤；當miR-132表達低時，可增加結腸癌細胞的活性和促進EMT。因此，miR-132在結腸癌中為抑癌基因。當心肌梗死相關轉錄因子(myocardial infarction associated transcript, MIAT)對miR-132形成競爭性抑制時，可以通過miR-132/Derlin-1軸促進結腸癌細胞的增殖、浸潤和轉移[27]。

2.4.2miR-132與結腸癌耐藥的關系 細胞外信號調節激酶1(extracellular signal-regulated kinase 1, ERK1)是ERK/MAPK信號通路中的重要蛋白。ERK/MAPK信號通路可調節多種生物過程，如細胞周期、細胞增殖、凋亡、遷移和浸潤。ERK1接收到上游的級聯信號后，可以磷酸化胞質蛋白并將其轉運到胞核，進一步調節各種核轉錄因子(如c-fos和c-Jun)，從而逆轉結腸癌細胞的阿霉素耐藥[28]。

3 miR-132臨床診斷、治療價值及展望

總之，大量研究證明miR-132在肝癌、胰腺癌、胃癌、結腸癌等多種消化系統惡性腫瘤中異常表達，其基因功能仍存在一定的爭議。在肝癌、結腸癌中miR-132被認為是抑癌基因，而在胰腺癌、胃癌中miR-132是作為癌基因還是抑癌基因尚存爭議。miR-132在消化系統惡性腫瘤中通過不同的細胞信號傳導途徑發揮作用，因此可能成為檢測腫瘤進展的有效指標，也有望成為抗腫瘤藥物研發的新靶點。