新舊兩版指南對浸潤性乳腺癌HER-2基因擴增的判讀影響

張 瑩，王 哲，楊向紅

乳腺癌是全球女性常見的惡性腫瘤之一，近年乳腺癌的發病率逐年升高，并呈年輕化趨勢[1]。有研究發現，曲妥珠單抗對浸潤性乳腺癌組織中HER-2基因擴增患者的分子靶向治療取得較好療效，因此明確HER-2基因狀態對乳腺癌患者治療尤為重要[2]。目前HER-2檢測方法有免疫組化(immunohistochemistry, IHC)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、顯色原位雜交(chromogenic in situ hybridization, CISH)、雙色銀染原位雜交(dual-color in situ hybridization, DISH)等。本文采用IHC和FISH兩種方法進行HER-2蛋白表達和基因擴增檢測，分析其一致性；應用《乳腺癌HER-2檢測指南(2014版)》[3](簡稱舊版指南)和《乳腺癌HER-2檢測指南(2019版)》[4](簡稱新版指南)進行判讀，探討新舊兩版指南對判讀結果的影響，旨在為臨床靶向用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年1月～2020年10月中國醫科大學附屬盛京醫院存檔的乳腺浸潤性導管癌組織石蠟標本698例，其中手術切除標本575例，粗針穿刺標本123例。所有患者均為女性，年齡23～84歲，中位年齡53歲，術前均未接受新輔助治療。采用IHC和FISH法進行HER-2蛋白表達和基因擴增檢測，根據新舊兩版指南判讀標準，由兩位病理醫師閱片判讀。

1.2 方法

1.2.1IHC 標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續3 μm厚切片3張，分別進行HE、IHC、FISH染色。IHC使用HER-2/neu兔單克隆抗體(4B5，羅氏診斷公司)，Ventana BenchMark XT 全自動免疫組化儀檢測，每例標本均設有陰、陽性對照。

1.2.2FISH 使用HER-2基因擴增檢測試劑盒(北京金菩嘉公司)。(1)石蠟切片65 ℃烤片2 h，常規脫蠟。(2)預處理：100%乙醇脫二甲苯5 min，去離子水3 min，水煮20 min。(3)酶消化：37 ℃預熱的胃蛋白酶工作液中消化10 min。(4)梯度乙醇脫水。(5)變性及雜交：滴加探針混合液，蓋玻片，封片膠封固，85 ℃ 5 min，42 ℃孵育16～18 h。(6)雜交后處理：46 ℃ 2×SSC洗滌5 min，46 ℃ 0.1%NP-40洗滌2 min，70%乙醇3 min，暗處自然干燥。(7)DAPI(4′6-二脒基-2-苯基吲哚)復染、封片。(8)熒光顯微鏡下判讀。

1.3 結果判讀IHC結果判讀：根據舊版指南無染色或≤10%的浸潤癌細胞呈不完整的、微弱的細胞膜染色為0；>10%的浸潤癌細胞呈不完整的、微弱的細胞膜染色為1+；>10%的浸潤癌細胞呈弱～中等強度的完整細胞膜染色，或≤10%浸潤癌細胞呈強而完整的細胞膜染色為2+；>10%的浸潤癌細胞呈強而完整且均勻的細胞膜染色為3+。新版指南與舊版指南判讀結果基本相同。

FISH結果判讀：在低倍鏡下觀察整張FISH切片，判斷檢測質量以及是否存在HER-2基因擴增的異質性。找到至少2個浸潤癌區域，隨機計數30個浸潤癌細胞中的雙色信號(要求細胞核大小一致、核邊界完整、DAPI染色均一、細胞核無重疊、信號清晰)。雙探針FISH判讀標準詳見圖1、2。

圖1 舊版指南HER-2雙探針FISH檢測判讀標準：a表示均質、連續的浸潤細胞，且占浸潤癌的10%以上

1.4 統計學方法采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，對IHC與FISH法檢測的HER-2蛋白表達與基因擴增結果進行Kappa一致性分析及Spearman等級相關分析，本實驗以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 舊版指南判讀在698例乳腺浸潤性導管癌患者中，IHC法進行HER-2蛋白檢測，合計檢測HER-2(0)、HER-2(1+)患者116例，檢出率為16.6%(116/698)；HER-2(2+)患者402例，檢出率為57.6%(402/698)；HER-2(3+)患者180例，檢出率25.8%(180/698)(圖3)。

圖3 HER-2蛋白表達，Ventana Ultraview DAB 法：A.HER-2(0)；B.HER-2(1+)；C.HER-2(2+)；D.HER-2(3+)

FISH法進行HER-2基因擴增檢測，HER-2基因擴增陽性284例，檢出率為40.7%(284/698)；HER-2基因擴增陰性364例，檢出率為52.1%(364/698)；HER-2基因擴增結果不確定50例，檢出率為7.2%(50/698)。

圖2 新版指南HER-2雙探針FISH檢測判讀標準：a表示IHC檢測HER-2(3+)呈陽性；HER-2(0)、HER-2(1+)、HER-2(2+)均呈陰性

2.2 新版指南判讀在698例乳腺浸潤性導管癌中，FISH法檢出HER-2基因擴增陽性279例，檢出率為40.0%(279/698)；FISH法檢測HER-2基因擴增陰性419例，檢出率為60.0%(419/698)。IHC法檢測HER-2蛋白表達結果與舊版指南判讀結果一致。

2.3 新版與舊版指南判讀分析與舊版指南判讀結果相比，新版FISH法檢測HER-2基因擴增陽性由40.7%降至40.0%，FISH法檢測HER-2基因擴增結果不確定由7.2%降至0，FISH法檢測HER-2基因擴增陰性由52.1%升至60.0%。在698例FISH法檢測HER-2基因擴增結果中，642例新舊兩版判讀結果相同，一致率為92.0%(642/698)，56例兩版判讀結果不同(8.0%，56/698)。56例中舊版指南FISH法檢測HER-2基因擴增陽性而新版指南為陰性的6例，舊版指南FISH法檢測HER-2基因擴增結果不確定而新版指南為陽性1例，舊版指南FISH法檢測HER-2基因擴增不確定而新版指南陰性49例(圖4)。

圖4 FISH法檢測HER-2基因擴增結果(HER-2呈紅色，CEP17呈綠色)：A.HER-2信號連接成簇；B.HER-2/CEP17比值≥2.0，平均HER-2拷貝數≥4.0信號/細胞；C.HER-2/CEP17比值≥2.0，平均HER-2拷貝數<4.0信號/細胞；D.HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷貝數≥6.0信號/細胞；E.HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷貝數≥4.0且<6.0信號/細胞；F.HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷貝數<4.0信號/細胞

2.4 IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的一致性分析根據舊版指南判讀，IHC法檢測HER-2蛋白表達0、1+與FISH法檢測HER-2基因擴增陰性符合率為88.8%(103/116)，IHC法檢測HER-2蛋白表達2+與FISH法檢測HER-2基因擴增陽性符合率為27.9%(112/402)，IHC法檢測HER-2蛋白表達3+與FISH法檢測HER-2基因擴增陽性符合率為92.8%(167/180)。IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的總一致率為54.7%(382/698)，結果存在一致性(Kappa=0.277，P<0.001)，且呈正相關(r=0.608，P<0.001，表1)。

表1 舊版指南IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的一致性分析

根據新版指南判讀，IHC法檢測HER-2蛋白表達0、1+與FISH法檢測HER-2基因擴增陰性符合率為97.4%(113/116)，IHC法檢測HER-2蛋白表達2+與FISH法檢測HER-2基因擴增陽性符合率為26.9%(108/402)，IHC法檢測HER-2蛋白表達3+與FISH法檢測HER-2基因擴增陽性符合率為93.3%(168/180)。IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的總一致率為55.7%(389/698)，結果存在一致性(Kappa=0.251，P<0.001)，且呈正相關(r=0.641，P<0.001，表2)。

表2 新版指南IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的一致性分析

3 討論

HER-2基因屬于EGFR家族成員之一，主要通過與家族其他成員形成異二聚體與配體結合，激活下游信號傳導途徑，從而促進腫瘤的發生與發展[5-7]。研究發現，在乳腺癌、胃癌、肺癌、結直腸癌中均檢測出HER-2基因擴增或HER-2蛋白的過表達，13%～20%的乳腺癌患者HER-2檢測陽性，并有部分患者從分子靶向治療中獲益[8-10]。因此，明確HER-2基因狀態對乳腺癌患者的個體化治療尤為重要。

根據新版指南判讀，本組FISH法檢測HER-2基因擴增陽性檢出率為40.0%，IHC法檢測HER-2蛋白表達3+檢出率為25.8%，IHC法檢出率與文獻報道基本一致[11-12]。由于FISH法檢測參照的判讀標準不同，導致文獻報道的FISH法檢測HER-2基因擴增陽性檢出率不一[11-13]。本組通過對698例浸潤性乳腺癌患者的IHC和FISH結果以舊版指南再判讀發現，新版指南結合了HER-2/CEP17比值、平均HER-2拷貝數和IHC結果綜合評估，取消了FISH法檢測HER-2基因擴增的不確定結果，使不確定結果由7.2%降至0。FISH法檢測HER-2基因擴增陽性由40.7%降至40.0%，FISH法檢測HER-2基因擴增陰性由52.1%升至60.0%，為臨床提供了更明確的HER-2基因狀態。此外在698例中，有56例新舊兩版指南判讀結果不同，其中6例為HER-2/CEP17比值≥2，平均HER-2拷貝數<4.0信號/細胞，在新版指南中FISH結果為陰性，現有的臨床試驗數據中，缺乏充分依據顯示此部分患者能從靶向治療中獲益[14-15]，新版指南判讀結果與臨床試驗數據相符。另有50例為HER-2/CEP17比值<2，平均HER-2拷貝數≥4.0且<6.0信號/細胞，根據新版指南判讀，1例結合IHC 3+結果，FISH結果為陽性，49例結合IHC 0、1+、2+結果，FISH結果為陰性。此部分患者能否從靶向治療中獲益目前尚不確定，需要更充分的循證醫學依據[16-17]。

本組結果顯示，根據新舊兩版指南判讀，IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增結果均存在一致性(Kappa=0.277，P<0.001；Kappa=0.251，P<0.001)，且均呈正相關(r=0.608，P<0.001；r=0.641，P<0.001)，與文獻報道一致[18-19]。經對比分析發現，根據新版指南判讀，IHC法檢測HER-2 (0、1+)、(3+)與FISH法檢測HER-2基因擴增結果的符合率明顯增加(97.4%，93.3%)，IHC法檢測HER-2 (2+)與FISH法檢測結果符合率降低(26.9%)，IHC與FISH法檢測的總一致率略有提高(55.7%)。新版指南中部分結果結合IHC綜合判讀，提高了IHC與FISH法檢測結果的一致性。同時本組結果也進一步驗證了指南中提出的，IHC法檢測HER-2(0)、(1+)判為陰性，HER-2(3+)判為陽性，HER-2 (2+)一致率較低，需應用FISH法進行HER-2基因擴增狀態檢測，為臨床提供多角度更精準的靶向治療依據。此外，指南中還提出所有乳腺原發性浸潤性癌均應進行HER-2檢測，只要能獲取腫瘤組織，對復發灶、轉移灶也應進行HER-2檢測。本組698例均為原發性浸潤性乳腺癌，對復發灶、轉移灶HER-2檢測結果需跟蹤患者后續治療以進一步分析。

此外，在595例計數17號染色體著絲粒CEP17信號中發現平均CEP17拷貝數≥3信號/細胞者有128例(21.5%，28/595)。近年有研究顯示整條17號染色體的多體罕見，CEP17的增加并不能代表整條17號染色體多體，部分乳腺癌中存在HER-2基因與著絲粒的共擴增[20]。17號染色體的異常與乳腺癌的預后或靶向治療是否相關，尚未有明確報道，有待于進一步分析。

綜上所述，新舊兩版指南IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增結果均存在一致性，且兩者均呈正相關。新版指南結合HER-2/CEP17比值、平均HER-2拷貝數和IHC結果綜合評估，取消了FISH法檢測HER-2基因擴增的不確定結果，使其陰性率有所增加，為臨床提供了更完善的靶向治療依據。