乳腺癌HER-2免疫組化簡易質控芯片的應用

王 弦，江冬瑞，李曉燦，黃成晨，吳 強

HER-2基因屬于原癌基因，HER-2陽性乳腺癌惡性程度較高且易復發轉移。目前國內外已有針對HER-2基因過表達的靶向藥物(赫賽汀)，可大大降低乳腺癌患者的惡性風險。因此，確定乳腺癌HER-2的狀態非常重要。針對HER-2的檢測方法主要有免疫組化法和原位雜交法，原位雜交法中熒光原位雜交法效果最佳，其是直接針對HER-2基因擴增檢測，并設置了17號染色體著絲粒作為內對照[1-2]，但該方法對實驗設備、操作人員要求均較高，檢測費用是免疫組化法的10～15倍。因此，乳腺癌患者應先行HER-2免疫組化檢測，如果判讀為2+，可再行熒光原位雜交法檢測。然而，國內醫院病理科因檢測水平參差不齊、主觀判讀因素及抗體原因，導致HER-2判讀為2+的檢測可重復性不高。因此，免疫組化法檢測乳腺癌患者HER-2表達添加質控對照顯得尤為重要。本科室在多年標準化檢測HER-2的基礎上，利用組織芯片的原理并借鑒成功經驗[3]，摸索出制作乳腺癌HER-2免疫組化簡易芯片對照的方法，可使染色結果判讀更為客觀，效果良好，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 標本收集2019年1月～2020年4月安徽醫科大學第二附屬醫院病理科存檔的乳腺癌手術標本30例作為供體蠟塊，患者均為女性。所有標本均經10%中性緩沖福爾馬林固定，常規脫水，透明，浸蠟，包埋。

1.2 試劑及設備全自動免疫組化儀；抗HER-2兔單克隆抗體(克隆號4B5，即用型)、UrtalView HRP-Multimer DAB免疫組化檢測試劑盒、CC1(pH 9.0)修復液、Reaction Buffer緩沖液、EZ脫蠟液、LCS液蓋膜；正電荷黏附載玻片。

1.3 方法

1.3.1供體標本的染色 所有供體蠟塊4 μm厚切片，使用正電荷黏附載玻片撈片，65 ℃烤片2 h；全自動免疫組化儀按照預設程序染色(CC1修復液100 ℃ 修復30 min；一抗HER-2 37 ℃孵育32 min；二抗系統HRP-Multimer 37 ℃孵育8 min；DAB顯色37 ℃ 8 min；蘇木精復染)；染色結束后人工清洗玻片并脫水透明封固。

1.3.2結果判讀 HER-2陽性定位于腫瘤細胞膜，結果判讀標準參考《乳腺癌HER2檢測指南(2019版)》[2]。

1.3.3供體蠟塊的選擇及簡易芯片的制作 (1)從30例供體蠟塊中選擇染色效果最佳的-、1+、2+、3+各1例；(2)鏡下觀察切片，選定目標區域并調取相對應蠟塊，并用記號筆在蠟塊上對應區域做標記；(3)融解蠟塊，用刀片切取標記的組織區域，切取組織區域，大小3 mm×3 mm，然后將切取的組織依次按照-、1+、2+、3+的順序包埋在同一蠟塊中；(4)在檢測乳腺癌中HER-2的表達時，可將上述簡易芯片對照裱在切片一端，與待檢組織同時染色，染色程序同1.3.1。

2 結果

2.1 供體蠟塊HER-2免疫組化染色30例供體蠟塊免疫組化檢測結果：HER-2(3+)9例，HER-2(2+)6例，HER-2(1+)8例，HER-2(-)7例(圖1)。

圖1 HER-2的表達，EnVision法：A.3+；B.2+；C.1+；D.-

2.2 簡易芯片的制作及應用乳腺癌HER-2免疫組化簡易芯片蠟塊制作較為便利、排列有序、體積小、識別度高；易于標記和使用，可重復性強(使用完以后可再次挑選蠟塊制作)(圖2)。對制作完成后的簡易芯片應用于待檢組織HER-2免疫組化染色，芯片內各點染色結果與初篩時供體蠟塊染色相同，無脫片、無移位(圖3)。

圖2 簡易芯片蠟塊：A～D分別為HER-2 (3+)、(2+)、(1+)、(-) 圖3 簡易芯片應用于待檢組織：左側A～D為簡易芯片，右側為待檢組織

3 討論

乳腺癌是女性高發惡性腫瘤之一，近年來發病率在我國呈逐年上升趨勢，且臨床復發率較高[4]。有研究表明，乳腺癌的發病與家族史、年齡、環境因素、內分泌因子及乳腺癌相關基因調控因子均有一定的關系[5]，故對于乳腺癌患者，早發現、早診斷、早治療顯得尤為重要。近20年來，免疫學及分子生物技術的運用給乳腺癌的早期診斷帶來希望，尤其是分子靶向藥物的研發和應用使大量乳腺癌患者受益，乳腺癌的病死率較之前大大降低。因此，能否正確診斷乳腺癌并明確其類型，尤其是明確腫瘤相應靶蛋白的表達，對于臨床正確選擇用藥極其重要。

近年來，針對治療HER-2陽性乳腺癌的曲妥珠單抗赫賽汀在臨床上取得了較好的效果，一些新藥如帕妥珠單抗、拉帕替尼等也逐漸應用于臨床。因此，正確而有效的檢測HER-2基因狀態或其蛋白是否高表達是乳腺癌患者治療用藥和預后評價的關鍵。2006年我國發布了《乳腺癌HER-2檢測指南》，截至2019年，專家多次對《乳腺癌HER-2檢測指南》進行更新，在乳腺癌檢測的標準化、規范化及其判讀的客觀化等方面進行指導，極大提高了我國的乳腺癌診斷水平。然而，我國乳腺癌HER-2的免疫組化檢測水平不一，發達地區地市級以上醫院病理科基本配備了全自動免疫組化染色儀，能夠按照最新的《乳腺癌HER2檢測指南(2019版)》[2]標準采用推薦的抗體及方法標準化檢測，并建立了本實驗室的SOP(實驗室標準操作規程)，但更多的基層醫院由于經濟條件、技術水平等因素限制，并不能對HER-2的免疫組化進行規范檢測。因此，為了保證診斷結果的準確性，乳腺癌HER-2的免疫組化檢測需設立陽性對照，最好應設立已明確的具有不同HER-2染色強度的對照，從而保證不同批次染色的客觀性。

本實驗建立的HER-2簡易芯片對照借助了組織芯片的原理，將HER-2不同陽性狀態的組織整合到一個蠟塊中，在進行免疫組化法檢測乳腺癌中未知HER-2水平時作為對照裱附在同一張切片上。該技術具有如下優點：(1)傳統的組織芯片制作需要有組織芯片儀，制作復雜，且對技術人員熟練程度要求高，難以掌握。本實驗不需要組織芯片儀，僅需要調取選擇蠟塊后融化，切割后重新包埋，簡單，易于掌握，成本低，易推廣；(2)簡易芯片中具備了HER-2(-)、(1+)、(2+)、(3+)四種狀態的對照組織，與傳統的單一陽性對照相比，其更為客觀有效；(3)簡易組織芯片構成比較單一，排列整齊，便于觀察；(4)簡易組織芯片體積小，可裱附在檢測片的任何一端，與檢測片同時檢測，在相同條件下檢測出染色結果，保證了實驗結果的可比性。同時，針對使用全自動免疫組化儀的單位，也可以使用該簡易芯片裱附在切片上任何區域，用來檢測機器在運行時抗體混勻的狀態；(5)該簡易芯片質控樣本來源廣泛，可多次制作，在不同實驗室之間可進行室間質控交流。

綜上所述，采用簡易芯片法制作HER-2免疫組化對照，設計科學，簡易可行，使免疫組化檢測結果判讀更為客觀可靠，值得推廣。