黑果腺肋花楸多糖的提取及抗氧化活性研究

馬士超 賈艷菊 馬啟迪 張壽常 林龍慧美 于夢 李振

摘要 [目的]研究黑果腺肋花楸多糖的最佳提取工藝，并考察其體外抗氧化活性。[方法]采用超聲波輔助提取，探究提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率、料液比對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響，采取正交試驗(yàn)法對其工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行體外抗氧化活性分析。[結(jié)果]超聲波輔助提取黑果腺肋花楸多糖最佳工藝為提取時(shí)間30 min、料液比1∶25、提取溫度30 ℃、超聲功率360 W，在此條件下，黑果腺肋花楸多糖提取率為13.09%。在黑果腺肋花楸多糖濃度為6.0 mg/mL時(shí)，其對·OH清除率為73.08%;當(dāng)濃度為0.60 mg/mL時(shí)，其在所選濃度范圍內(nèi)還原能力最大，吸光度為0.879，對DPPH自由基的清除率達(dá)97.99%。[結(jié)論]該研究可為黑果腺肋花楸多糖工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，并對其食品開發(fā)具有重要意義。

關(guān)鍵詞 黑果腺肋花楸;多糖;提取;抗氧化活性

中圖分類號 R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2021）02-0154-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.042

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Sorbus arborescens

MA Shichao，JIA Yanju，MA Qidi et al

（College of Pharmacy，Linyi University，Linyi，Shandong276005）

Abstract [Objective]To study the best extraction process of polysaccharides from Sorbus arborescens and to investigate its antioxidant activity in vitro. [Method]Ultrasoundassisted extraction was used to explore the effects of extraction temperature， extraction time， ultrasonic power， and solidliquid ratio on the extraction rate of polysaccharides from S. arborescens， and orthogonal process was used to optimize its process parameters. The antioxidant activity in vitro was analyzed. [Result]The best technology of ultrasonicassisted extraction of polysaccharides from S. arborescens was extraction time 30 min， solidliquid ratio 1∶25， extraction temperature 30 ℃， ultrasonic power 360 W. Under those conditions， the extraction rate of S. arborescens polysaccharide was 13.09%. At the concentration of 6.0 mg/mL polysaccharides of S. arborescens， the scavenging rate for hydroxyl radicals was 73.08%; when the concentration was 0.60 mg/mL， the reducing power（0.879） was the largest in the selected concentration range， for DPPH，the free radical scavenging rate reached 97.99%. [Conclusion] This research can provide a theoretical basis for the industrial production of polysaccharides from S. arborescens and has important significance for the development of its food.

Key words Sorbu arborescens;Polysaccharides;Extraction;Antioxidant activity

黑果腺肋花楸又名野櫻莓、不老莓，屬薔薇科植物[1-2]。原盛產(chǎn)于北美州的東北部，國外已經(jīng)有幾百年的種植經(jīng)驗(yàn)[3-4]。其果實(shí)中含有豐富的原花青素、酚酸、多糖等多種活性成分[5-6]，具有抗疲勞、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等作用[2]。多糖是由醛基和羰基通過苷鍵連接的高分子聚合物，廣泛存在于植物中，可清除機(jī)體自由基，防治細(xì)菌、病毒、腫瘤、糖尿病等疾病。因此，積極開發(fā)植物多糖具有重要的臨床價(jià)值。該研究擬測定黑果腺肋花楸多糖的含量，篩選出最佳提取工藝，考察其體外抗氧化作用，以期為黑果腺肋花楸的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：黑果腺肋花楸果實(shí)（遼寧鞍山）;試劑：葡萄糖（分析純）、濃硫酸、6%苯酚、70%乙醇、水楊酸、無水乙醇、FeSO4、H2O2、NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、K3[Fe（CN）6]、三氯乙酸（TCA）、FeCl3、Tris-HCl緩沖液（pH=8.2）、鄰苯三酚均為市售分析純試劑。試驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1820紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;BSA124S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）;KQ-600E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;DJ-10A粉碎機(jī)（青州精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司）;TG16-WS離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;DK-S26電熱恒溫水浴鍋（上海森信試驗(yàn)儀器有限公司）;BCD-331WDGQ冰箱（海爾集團(tuán)）。

1.3 方法

1.3.1 材料處理。

取黑果腺肋花楸果實(shí)，烘干，粉碎，過80目篩，備用。

1.3.2

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精確稱取經(jīng)干燥恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加蒸餾水溶解并定容至100 mL，配成100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 置于試管中，加蒸餾水至 10.0 mL。分別用移液管移取2.0 mL 于比色管中，加入苯酚溶液 1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL 濃硫酸搖勻，靜置10 min，40 ℃水浴30 min。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

試驗(yàn)所得線性回歸方程為y=0.017 3x+0.049 0，式中y為吸光度（A），x為質(zhì)量濃度（μg/mL），R2=0.987 6，表明在該濃度范圍內(nèi)葡萄糖濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

1.3.3 黑果腺肋花楸多糖提取率的測定。

取一定量的黑果腺肋花楸果實(shí)粉末溶于70%乙醇溶液中，采用超聲波輔助提取;濾紙過濾，濾液條件為 5 000 r/min 離心10 min;取上清液定容于 50 mL容量瓶，根據(jù)苯酚-硫酸法測定黑果腺肋花楸多糖含量，根據(jù)下式計(jì)算黑果腺肋花楸多糖的提取率：

黑果腺肋花楸多糖提取率=10-6XVnm×100%

式中，n為稀釋倍數(shù);X為葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL）;V為提取液體積（mL）;m為預(yù)處理后粗多糖質(zhì)量（g）。

1.3.4 單因素試驗(yàn)。

分別以料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]、超聲功率（240、300、360、420 W）、提取時(shí)間（10、20、30、40 min）、提取溫度（30、40、50、60 ℃）4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究各因素對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)。

以黑果腺肋花楸多糖提取率為評價(jià)指標(biāo)，考察超聲輔助提取中提取時(shí)間、料液比、提取溫度、超聲功率4個(gè)因素對黑果腺肋花楸多糖提取的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定各個(gè)因素的水平，并以此進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，因素和水平見表1。

1.3.6 黑果腺肋花楸多糖體外抗氧化活性測定。

1.3.6.1 ·OH清除率的測定。

對照組（A0）：1.0 mL蒸餾水+2.0 mL 9.0 mmol/L FeSO4+2.0 mL 9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液+2.0 mL 0.88 mmol/L H2O2溶液。樣品組（A1）：取1.0 mL 不同質(zhì)量濃度的黑果腺肋花楸多糖提取液+2.0 mL 9.0 mmol/L FeSO4+2.0 mL 9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液+2.0 mL 0.88 mmol/L H2O2溶液。空白組（A2）：1.0 mL蒸餾水+2.0 mL 9.0 mmol/L FeSO4+2.0 mL 9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液+2.0 mL蒸餾水。37 ℃水浴30 min，于510 nm波長處測定吸光度[8-9]。

·OH清除率=（1-A1-A2A0） ×100%

式中，A1為樣品溶液的吸光度;A0為對照溶液的吸光度;A2為空白溶液的吸光度。

1.3.6.2 還原力的測定。

取不同質(zhì)量濃度的黑果腺肋花楸多糖提取液1.0 mL于試管中，各加入2.0 mL 0.2 mol/L pH為6.6的磷酸鹽緩沖溶液和1%K3[Fe（CN）6]溶液混勻，50 ℃水浴20 min后，立即冷卻至室溫，加入2.0 mL10%三氯乙酸，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液2.0 mL，加入2.0 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%FeCl3溶液，搖勻，常溫下反應(yīng)30 min后，用蒸餾水代替樣品作為空白，于700 nm波長處測定吸光度。吸光度越大表明還原力越大[10]。

1.3.6.3 DPPH自由基清除能力的測定。

參考Brand[7]的方法測定，取不同質(zhì)量濃度的黑果腺肋花楸多糖提取液1.0 mL于試管中，分別加入4 mmol/L DPPH乙醇溶液 1.0 mL，混勻，暗處靜置30 min，以2.0 mL乙醇作為空白，1.0 mL 4 mmol/L DPPH乙醇溶液與1.0 mL乙醇混合液作為對照，于517 nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除活性（RAS）計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率=（1-A1/A0）×100%

式中，A1為樣品溶液的吸光度;A0為對照溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響。

由圖2可知，在超聲功率為360 W、提取時(shí)間30 min、提取溫度50 ℃條件下，料液比對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響結(jié)果：料液比在1∶10～1∶15時(shí)黑果腺肋花楸多糖提取率顯著增加;料液比1∶20～1∶25時(shí)，提取率顯著降低;料液比為1∶15時(shí)多糖提取率達(dá)到峰值，為11.49%。故最佳料液比為1∶15。

2.1.2 超聲功率對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響。

由圖3可知，在料液比1∶15、提取時(shí)間30 min、提取溫度50 ℃條件下，超聲功率對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響結(jié)果：超聲功率在240～360 W時(shí)，提取率隨超聲功率的增大而增加;360 W以后提取率呈減小趨勢，最大提取率為11.56%。故最佳超聲功率為360 W。

2.1.3 提取時(shí)間對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響。

由圖4可知，在料液比1∶15、提取溫度50 ℃、超聲功率360 W條件下，提取時(shí)間對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響結(jié)果：在10～30 min，隨提取時(shí)間的增加，黑果腺肋花楸多糖提取率不斷增加;在30 min后，提取率呈下降趨勢，最大提取率為1017%。故最佳提取時(shí)間為30 min。

2.1.4 提取溫度對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響。

由圖5可知，在料液比1∶15、提取時(shí)間30 min、超聲功率360 W條件下，提取溫度對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響結(jié)果：30～40 ℃ 時(shí)提取率呈緩慢增加趨勢;50～60 ℃時(shí)提取率呈緩慢下降趨勢，最大提取率為11.69%。故最佳提取溫度為40 ℃。

2.2 黑果腺肋花楸多糖提取工藝的優(yōu)化

在超聲輔助乙醇法提取黑果腺肋花楸多糖單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，研究黑果腺肋花楸多糖的提取率與料液比、提取溫度、超聲時(shí)間、超聲功率之間的相互關(guān)系，并確立最優(yōu)組合，以得到黑果腺肋花楸多糖的最佳提取條件，上述4因素各取3水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

通過提取率極差分析結(jié)果可知，影響黑果腺肋花楸多糖提取率的因素依次為B>A>D>C，即料液比影響最大，提取溫度影響最小。試驗(yàn)指標(biāo)提取率越大越好，從k得出黑果腺肋花楸多糖的最佳提取條件為A3B3C1D2，即提取時(shí)間30 min、料液比1∶25、提取溫度30 ℃、超聲功率360 W。由方差分析結(jié)果可知，因素B 對黑果腺肋花楸多糖提取率有顯著影響（P<0.05），因素 A、C、D 對黑果腺肋花楸多糖提取率無顯著影響（P>0.05），對多糖提取率影響的主次順序?yàn)锽>A>D>C，即料液比、提取時(shí)間、超聲功率、提取溫度，與直觀分析結(jié)果一致。

2.3 黑果腺肋花楸多糖體外抗氧化活性測定

2.3.1 黑果腺肋花楸多糖對·OH清除率的影響。

·OH一般被認(rèn)為是活性最強(qiáng)的自由基，也是毒性最大的自由基，是造成生物有機(jī)體過氧化損傷的主要因素，輻射損傷等物理、化學(xué)因子都會促進(jìn)其形成[11]。由圖6可知，在所選濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增大，黑果腺肋花楸多糖對·OH清除率也逐漸增大，當(dāng)多糖濃度為6.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)73.08%。

2.3.2 黑果腺肋花楸多糖還原力的測定。

由圖7可知，在所選濃度內(nèi)，隨著黑果腺肋花楸多糖濃度的提高，其還原力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)多糖濃度為6.0 mg/mL時(shí)，其對鐵還原能力為最大，吸光度為0.879。

2.3.3 黑果腺肋花楸多糖對DPPH自由基清除率的測定。

DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于其單電子配對而使其顏色由深紫色褪至黃色，其褪色程度與自由基清除能力存在一定的關(guān)系，被色程度越明顯，清除能力越強(qiáng)[12-14]。由圖8可知，黑果腺肋花楸多糖對DPPH自由基有明顯的清除能力。在所選濃度內(nèi)，多糖的清除能力隨其濃度的增加而增大，在濃度為0.60 mg/mL時(shí)，黑果腺肋花楸多糖對DPPH的清除率達(dá)97.99%。

3 結(jié)論

該研究采用超聲輔助提取黑果腺肋花楸多糖，通過考察

料液比、提取時(shí)間、提取溫度和超聲功率對黑果腺肋花楸多糖提取率的影響，結(jié)果表明當(dāng)料液比為1∶25、提取溫度為30 ℃、提取時(shí)間為30 min、超聲功率為360 W時(shí)，黑果腺肋花楸多糖提取率最高，為13.09%。黑果腺肋花楸多糖對 DPPH、·OH均具有較強(qiáng)的清除能力，且隨多糖濃度的增加清除能力也逐漸增強(qiáng)，在黑果腺肋花楸多糖濃度為6.0 mg/mL時(shí)，對·OH清除能力為73.08%;在黑果腺肋花楸多糖濃度為0.60 mg/mL時(shí)，在所選濃度內(nèi)還原能力最大，吸光度為0.879，對DPPH自由基的清除率達(dá)97.99%。由此可知，黑果腺肋花楸多糖具有一定的抗氧化活性。

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