新型冠狀病毒肺炎免疫反應與疫苗開發(fā)的研究進展

付鈺倩，蘆增增，黃妙惠

（福建師范大學南方生物醫(yī)學研究中心；福建省天然免疫生物學重點實驗室，福建 福州 350117）

2019 年底，在中國湖北省武漢市爆發(fā)了由新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）引起的呼吸道疾病，此后該病毒迅速蔓延至不同國家和地區(qū)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新公布的最新數(shù)據(jù)顯示，截至2021年1月16日，全球新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019,COVID-19）累計感染超過9200萬人，造成200萬人死亡。COVID-19感染者主要表現(xiàn)為肌肉酸痛、渾身乏力，發(fā)熱、胸悶、呼吸困難等癥狀，嚴重情況下可導致急性呼吸窘迫綜合征及多器官功能衰竭等；這些病例的死亡率已占全球所有感染病例的約3.5%[1]；盡管病死率遠低于嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）和中東呼吸綜合征（middle east respiratory syndrome,MERS)，兩者分別為9.14%[2]和34.4%[3]；但是SARS-CoV-2具有高度傳染性（R0=1.4～3.9）[4]，且潛伏期長，可以通過無癥狀感染者傳播從而可能引發(fā)超級傳播。

SARS-CoV-2 屬于冠狀病毒一大類的正向單鏈RNA病毒，其基因組全長在26000～32000個堿基之間[5]；根據(jù)基因組序列分析，SARS-CoV-2與蝙蝠SARS樣CoVZXC21約89%相同，與人類SARS-CoV有82%相似性，具有與其他冠狀病毒相同的主要結構和分子特征（如圖1），包括結構蛋白的刺突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M和核衣殼蛋白N，這些蛋白負責病毒包膜的形成、穩(wěn)定性以及與RNA基因組相互作用[6]。病毒與宿主細胞在刺突蛋白S介導下，通過受體血管緊張素轉化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2）相互作用；刺突蛋白S還依賴于另一種宿主因子跨膜蛋白酶絲氨酸2(transmembrane serine protease 2,TMPRSS2)，TMPRSS2的活化可誘導病毒與細胞膜融合。廣泛的研究已經(jīng)揭示了病毒的起源、傳播機制和感染的臨床表現(xiàn)[7]，然而，關于SARS-CoV2的發(fā)病機理以及其與個體免疫系統(tǒng)之間的相互作用了解得不夠透徹。在COVID-19感染者中，部分個體呈現(xiàn)無癥狀，而有些患者則表現(xiàn)出嚴重的并發(fā)癥，例如間質性肺炎和呼吸衰竭[8-9]。為了開發(fā)新的治療方案和安全可靠的病毒疫苗，我們有必要了解SARS-CoV-2的致病機理和與免疫系統(tǒng)之間相互作用的關系。

圖1 SARS-CoV-2結構示意圖

1 SARS-CoV-2的致病機理

SARS-CoV-2 是感染人類的冠狀病毒家族中第七個成員。四個人類冠狀病毒（HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoVOC43和HCoV-HKU1）能夠引起廣泛的上呼吸道感染，而SARS-CoV和MERSCoV引起非典型肺炎；SARS-CoV和MERS-CoV通過內吞途徑進入細胞，利用表面刺突蛋白S分別結合纖毛支氣管上皮細胞ACE2受體和Ⅱ型肺細胞的二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4,DPP4）受體[10]。刺突蛋白S是SARS-CoV-2最重要的表面膜蛋白，由兩個亞基S1和S2組成，并被受體TMPRSS2裂解。S1亞基中的受體結合結構域介導病毒與宿主細胞的附著和細胞向性，而S2亞基含有膜融合所需的基本元件，在兩個串聯(lián)結構域七肽重復序列1和七肽重復序列2幫助下，病毒與細胞膜發(fā)生融合。病毒進入宿主細胞后，病毒RNA就會暴露出來。在細胞質中釋放的病毒基因組RNA會翻譯兩種不同的多聚蛋白，即蛋白磷酸酶1a和蛋白磷酸酶1b。這些多聚蛋白編碼在雙膜囊泡中形成復制轉錄復合物（replication and transcription complex, RTC）的非結構蛋白。RTC復制連續(xù)進行，并形成亞基因組RNA集合，該亞基因組RNA負責編碼輔助蛋白和結構蛋白。新形成的病毒基因組RNA，連同核衣殼蛋白，包膜糖蛋白，內質網(wǎng)和高爾基體聚集在一起，形成病毒顆粒芽，然后附著在質膜上導致病毒釋放[11]。

急性SARS-CoV2感染與季節(jié)性流感非常相似，最常見的癥狀就是發(fā)燒、咳嗽、呼吸急促和肌肉酸痛[12-13]，后期可能發(fā)展為肺炎、急性呼吸窘迫和腎衰竭等[14-16]。肺部是SARS-CoV-2感染的主要部位；研究表明，感染SARS-CoV2患者的胸部CT通常在后肺和周圍肺顯示雙側毛玻璃樣混濁性病變，這是COVID-19的主要特征[17]。對死于COVID-19患者的肺、肝和心臟的活檢樣品病理研究表明，肺是主要的受影響組織，其病理變化包括Ⅱ型肺細胞增生、肺泡上皮細胞受損、透明膜和彌漫性肺泡損傷[18]。ACE2是病毒刺突蛋白S的主要受體，為SARSCoV2的捕獲和感染人類細胞提供了切入點。有報道指出SARS-CoV2也可以通過 DC-SIGN(CD209)、CD147和L-SIGN(CD209L）等受體進入細胞，因此，干擾刺突蛋白S與ACE2、CD147、DC-SIGN或L-SIGN的相互作用，或者用它們基因表達的藥物可能會抑制病毒的侵襲[19]。

2 SARS-CoV-2與先天免疫系統(tǒng)

先天免疫系統(tǒng)是維護機體良好運行的一種防御機制，可快速識別病原體的攻擊，并促進適應性免疫反應發(fā)生。先天免疫系統(tǒng)主要是通過模式識別受體（pattern recognition receptor,PRR）識別病原體分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMP)，包括RIG-I樣受體、Toll樣受體、NOD樣受體和宿主細胞質中的自由分子受體等[20]。病毒感染的識別始于宿主細胞PRR對病毒核酸的檢測，通過招募接頭蛋白，由泛素連接酶和激酶向下游發(fā)出信號，最終導致轉錄因子和免疫基因的表達，如干擾素（interferon,IFN)、細胞因子和趨化因子等。

SARS-CoV 和SARS-CoV-2表現(xiàn)出高度的遺傳相似性，因此二者的免疫反應也極其相似。IFN途徑能夠快速有效地清除病毒感染，冠狀病毒已進化出多種機制來靶向PRR-IFN途徑中的信號傳導成分，干擾下游信號傳導或抑制特定的IFN刺激基因（ISG）產(chǎn)物[21]，使其在宿主細胞中存活。SARSCoV-2抑制先天免疫系統(tǒng)的激活從某種程度解釋了為什么流感潛伏期為1～4天，而COVID-19潛伏期一般為2～12天。研究表明，在嚴重的COVID-19病例中，血液中炎性單核細胞和嗜中性粒細胞的數(shù)量顯著增加[22-23]，并且具有更高的IL-6/IFN-γ比值，這可能與導致肺損傷的細胞因子風暴有關[24]。細胞因子大量釋放，促進系統(tǒng)性炎癥發(fā)生，致使部分重癥患者病情急劇惡化，多器官功能迅速衰竭，危及患者生命安全。這可能也是為什么老年人和那些患有多種疾病的人更容易感染COVID-19的部分原因。目前，對于SARS-CoV-2與先天免疫系統(tǒng)的研究還在進一步深入中。

3 SARS-CoV-2與適應性免疫系統(tǒng)

病原體感染細胞可能觸發(fā)宿主體液免疫和細胞免疫，這是消除病毒感染所必需的。研究表明，有70%的COVID-19患者中均檢測到了病毒特異性CD4+T細胞應答和病毒特異性CD8+T細胞應答[25]。在COVID-19感染期間，CD8+T細胞數(shù)量減少[26]；并且在淋巴結和脾臟中檢測到細胞衰竭標志物NKG2A、PD-1和TIM-3的表達[27-28]，這說明了SARS-CoV2在增強細胞退變中的作用；在一些嚴重COVID-19病例中發(fā)現(xiàn)，Th17細胞數(shù)量增加[29]，患者肺中積聚的Th17細胞可導致COVID-19中所見的過度炎癥[30-31]。

SARS-CoV-2 與其他冠狀病毒相似，通過下調MHC I類和Ⅱ類分子來抑制抗原提呈，抑制T細胞介導的免疫反應。然而，體液免疫反應在COVID-19感染中也起著重要作用。中和抗體是由B細胞感染病毒后產(chǎn)生，可阻斷病毒進入宿主細胞，因此，中和抗體在病毒清除中起著至關重要的作用。由SARSCoV-2引起的體液免疫反應主要由針對病毒表面糖蛋白的抗體介導，主要是刺突蛋白S和核衣殼蛋白E。研究表明，在大多數(shù)感染者癥狀發(fā)作后的一到兩周內可檢測到SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體；COVID-19患者外周血漿細胞出現(xiàn)頻率顯著增加，而且中和抗體反應的程度與疾病的嚴重程度呈正相關。此外，中和抗體滴度與年齡也有相關性；因此，中和抗體可能成為疫苗開發(fā)的關鍵因子。關于SARS-CoV-2的免疫反應還有許多問題有待進一步解釋，通過不斷提高對適應性免疫系統(tǒng)與SARSCoV-2的關系理解有助于研發(fā)更加有效的疫苗和制定治療策略。

4 疫苗開發(fā)

疫苗是控制疾病最經(jīng)濟有效的一種手段，是對抗病毒最有效、長期的可持續(xù)措施；但不同于常規(guī)藥物的研制，疫苗的安全性是首要考慮的，因而往往任何一種疫苗的研發(fā)周期都可能需要長達數(shù)年。由SARS-CoV-2引成的大流行病已經(jīng)造成了全球人道主義和經(jīng)濟危機，多次報道表明SARS-CoV-2可以通過無癥狀感染方式進行傳播[32]，研究還發(fā)現(xiàn)有COVID-19患者在24天后才檢測出SARS-CoV-2陽性[33]，間接說明了為什么此次疫情能夠在短時間內迅速引起全球大流行趨勢，這對于病毒感染的控制極具挑戰(zhàn)；在疫苗尚未成功實施全球疫苗接種之前，這種流行病很難得到真正遏制，因此快速研發(fā)出一種高效、安全的COVID-19疫苗至關重要。

在開發(fā)COVID-19疫苗產(chǎn)品時，要著重考慮到三個關鍵因素：一是最大限度地減少免疫排斥；二是能適用于任何人群，尤其是超過60歲且存在多種基礎病并發(fā)癥的老人；三是方便儲存，保證疫苗的穩(wěn)定性。世衛(wèi)組織數(shù)據(jù)顯示，截至2020年年底，全球正在進行研發(fā)的新冠疫苗共有200多種，其中60多種進入臨床試驗階段，進入臨床三期試驗階段的有15種。根據(jù)疫苗研發(fā)技術平臺的不同，我們總結了以下4種不同技術路線的COVID-19疫苗研發(fā)進展（表1）。

表1 COVID-19疫苗研發(fā)進展

滅活疫苗是最經(jīng)典、成熟的一種技術路線，是指在體外使用滅活的病毒輸入到體內刺激人體產(chǎn)生免疫反應，這類疫苗安全性高，常需多次接種。目前我國已有3款滅活疫苗進入臨床研究階段，包括兩款國藥集團公司和一款科興中維的滅活疫苗。

病毒載體疫苗是通常以改造后的其他病毒（如腺病毒）作為運輸?shù)鞍踪|的載體，轉入細胞內表達病毒蛋白，從而在體內產(chǎn)生免疫反應。我國陳薇院士團隊研發(fā)的腺病毒載體重組新冠病毒疫苗是我國首個進入臨床研究的新冠疫苗；英國牛津大學研發(fā)的ChAdOx1載體疫苗也已進入Ⅲ期臨床。

核酸疫苗常指RNA和DNA疫苗，是一種使用經(jīng)過基因工程改造的RNA或DNA生成蛋白質的前沿方法，利用此種蛋白質安全地引發(fā)免疫反應。目前已有7款mRNA疫苗進入臨床階段，美國Moderna公司，輝瑞與BioNTech合作的mRNA疫苗均已緊急獲批使用；美國INOVIO公司研發(fā)的DNA疫苗已進入Ⅲ期臨床。

基因工程亞單位疫苗是通過基因工程的方法，將病毒中具有免疫活性的“亞單位”輸入體內，來激活機體產(chǎn)生針對病毒的特異性免疫。目前有美國Novavax研制的重組蛋白疫苗，中國科學院與智飛生物聯(lián)合研制的新冠疫苗。

盡管從目前公布的初步臨床數(shù)據(jù)來看，每種疫苗策略都有它的優(yōu)缺點；但最重要的是繼續(xù)快速推進多種疫苗研發(fā)策略向前發(fā)展，評估其安全性和有效性，最終達到消滅新冠病毒的目的。當前，在各國政府、公司、監(jiān)管機構和世衛(wèi)組織的大力支持下，新冠疫苗正以前所未有的速度向人們走來。

5 展望

在過去的短短一年內，COVID-19在全球范圍內迅速蔓延，呈指數(shù)型增長，這是一場極其嚴重的公共衛(wèi)生危機。了解COVID-19結構和致病機理有助于我們及時采取下一步措施。SARS-CoV-2與個體免疫系統(tǒng)的密切相互作用導致了COVID-19多種臨床表現(xiàn)。研究SARS-CoV-2如何修飾天然免疫細胞中的基因表達，SARS-CoV-2感染期間免疫系統(tǒng)發(fā)揮的作用，對于確定如何調節(jié)并改善患者預后的免疫調節(jié)療法和探討發(fā)病個體差異性十分必要。報道指出，解決IFN逃避機制和防止病毒免疫逃避可以有效提高病毒清除率。IL-6具有促炎和抗炎作用，也是COVID-19患者細胞因子風暴的主要驅動因素；在疾病晚期，阻斷IL-6可以減少病毒引起的過度炎癥反應，這有利于尋找新的潛在治療方法。

不管是SARS-CoV-2，還是未來爆發(fā)的類似冠狀病毒，對COVID-19恢復個體的免疫和長期記憶的評估可能有助于設計一種潛在的預防和治療藥物。此外，通過二代測序找到關于COVID-19臨床特征和開發(fā)藥物研究的關鍵信息，在此基礎上進一步完善對SARS-CoV-2的病理學和流行病學特點的深入研究。

此次疫情的嚴重性已經(jīng)重新塑造了我們的社會，不僅影響了全球經(jīng)濟、醫(yī)療系統(tǒng)以及人與人之間的互動方式，某種程度上也改變了大家的生活方式。回顧21世紀以來，我們必須清醒地意識到，從2000年代的SARS、2010年代的MERS和現(xiàn)在的COVID-19，我們所生存的環(huán)境每十年都有一種新的冠狀病毒流行病發(fā)生。BioNTech首席執(zhí)行官Ugur Sahin說，“我們需要習慣以后還會爆發(fā)更多疫情”。因此構建和推進疫苗研發(fā)平臺的發(fā)展，尤其是推進冠狀病毒疫苗的開發(fā)、制造和儲存，是保障全球安全的重要舉措。

經(jīng)過全球科研人員的不懈努力，截至2020年年底已有多種疫苗上市并投入使用。2020年12月31日，國藥集團新冠滅活疫苗獲得國家藥監(jiān)局批準上市。包括中國在內的疫苗上市為全球戰(zhàn)勝疫情注入信心，也為疫苗成為全球公共產(chǎn)品提供有力支撐。疫苗的上市給大家打了一針強心劑，與此同時我們也要加快其他藥物研發(fā)的速度，以防止疫苗效價低于預期和降低發(fā)病率和死亡率[34]。然而當前疫苗接種也存在一些問題，如接種疫苗后，保護將持續(xù)多久；接種疫苗能比自然感染后是否獲得更好的免疫原性；老人、免疫功能低下者和患有基礎病者對疫苗有效性和副作用風險的影響；以及如何實現(xiàn)疫苗的公平分配等；這些都是今后各國政府和科學家們急需解決的。

當前形勢下，全球范圍內必須繼續(xù)實施社會距離和適當?shù)男l(wèi)生預防措施，比如穿戴個人防護設備、控制人流量。此外，政府、科學家們應該利用傳統(tǒng)或社交媒體等方式做好進展匯報和科普工作，人們要相信政府、相信科學，不造謠、不傳謠。我們也要以這場疫情為警惕，做好應對突發(fā)事件的準備。在全球化快速發(fā)展的時代，國與國之間必須攜手合作。中國在這次疫情中展現(xiàn)了大國擔當，第一時間分享了抗疫方案，始終對疫苗國際合作持開放態(tài)度，也承諾將疫苗作為一種“全球公共產(chǎn)品”向世界各國提供。

未來的路還很漫長，但我們有理由相信終有一天我們一定能夠戰(zhàn)勝疫情！