酶解輔助預糊化技術工藝優化及風味物質差異分析

昝學梅，劉 明，劉艷香，孟 寧,3，劉翼翔，譚 斌,，田曉紅，方秀麗

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建廈門 361021；2.國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037；3.哈爾濱商業大學旅游烹飪學院，黑龍江哈爾濱 150076）

稻谷屬于禾本科稻屬，是水稻脫粒后得到的帶有不可食穎殼的籽粒；經礱谷處理，脫去穎殼，得到的籽粒稱為糙米；再經過碾米加工得到大米[1]。但由于全谷物糙米灰暗的外表和堅硬的質地使其蒸煮性、口感和吸收性較差[2]，所以不能作為現在的日常主食。而精白米雖然口感好、容易消化[3]，但缺乏有益于人體的健康成分，如維生素和纖維素等。

酶是由生物體活細胞產生的且具有特殊催化作用的一類蛋白質[4]，目前用于酶解顆粒態糙米的酶主要是纖維素酶和纖維素酶與木聚糖酶的混合酶等。這主要是因為糙米皮層主要成分為纖維素和阿拉伯木聚糖，木聚糖層與木質素共價連接、與纖維素非共價連接，此種交錯聯結的形式是賦予糠層抗性的基礎[5]。而酶解技術不僅可以破壞全谷物糙米的組織細胞壁，而且還可以改善糙米的蒸煮特性和食用品質等。Das 等[6]通過研究木聚糖酶和纖維素酶混合酶溶液對糙米皮層的影響，研究表明酶解糙米的水攝取率和膨脹率增加，糙米的表面結構變化，使糙米的蒸煮時間減少，糙米蒸煮食用品質提高。預糊化是一種物理改性方法[7]，淀粉經預糊化處理后具有綠色環保、分散性好、膨潤度高等特點，不僅可以作為增稠劑應用于食品行業，還可作為粘結劑、施膠劑等應用在醫藥化工等領域[8-10]。研究表明，將預糊化淀粉加入面團中，其強吸水性及結構的無序化可以改變面制品的醒發體積及凝膠特性，調控其品質[11-12]。酶解輔助預糊化技術是先利用添加外源酶對糙米表層的纖維素等物質進行降解，再通過預糊化對糙米胚乳進行物理改性的一種復合加工技術。目前，酶解技術和預糊化技術多用于改善糙米的蒸煮特性和食用品質，尚未見酶解輔助預糊化的復合加工技術在全谷物蒸煮品質和風味方面的研究報道。

風味是全谷物最重要的感官品質之一，揮發性風味物質刺激鼻腔嗅覺感受器直接影響全谷物品質評價和消費者接受能力[13]。迄今為止，在各種水稻中已鑒定出300 多種揮發性化合物，包括酮類、醛類、酯類、醇類、雜環類化合物[14]。因此，本試驗中采用響應面試驗設計研究糙米酶解輔助預糊化工藝參數（酶解時間、酶的添加量、預糊化時間和酶解溫度），采用蒸煮時間評價篩選出品質最優工藝條件，并用氣相-離子遷移譜（GC-IMS）檢測酶解輔助預糊化糙米蒸煮前后的揮發性風味物，旨在為糙米加工過程中揮發性成分變化規律提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑龍江長粒香（HCLX）五常市金禾米業有限責任公司；纖維素酶（全組分PL）寧夏夏盛實業集團有限公司提供。

GC（7890A）-MS（5975C）氣質聯用分析儀 美國安捷倫公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭 美國Supelco 公司；RDN 型分段可編程人工氣候箱 寧波東南儀器有限公司；HH-4 數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糙米的準備 稻谷經礱谷機礱出糙米，去除霉變糙米粒、雜質、未成熟粒和碎糙米粒，用聚乙烯自封袋封裝保存在4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 酶解輔助預糊化糙米處理 每組稱量糙米200 g，放入燒杯中，用純水洗滌3 次，然后用0.5%的次氯酸鈉溶液消毒15 min，之后再用純水洗滌3 次，按固液比1:3 g/mL 添加酶溶液（檸檬酸緩沖液pH5.0），然后將燒杯放入恒溫水浴鍋中。在設定溫度和時間下進行酶解，每15 min 翻料一次，糙米經酶解及預糊化后，90 ℃烘箱烘1 h。晾涼后-4 ℃冷藏保存。

1.2.3 單因素實驗 工藝流程：糙米除雜篩選→酶解→預糊化→干燥→備用。根據預實驗結果，以原料糙米為對照，分別在酶解溫度為40 ℃，酶的添加量為0.1%，預糊化時間為9 min 的固定條件下，考察酶解時間（3、4、5、6 h）對處理糙米蒸煮時間的影響；在酶解時間為4 h，酶解溫度為40 ℃，預糊化時間為9 min 的固定條件下，考察酶的添加量（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%）對處理糙米蒸煮時間的影響；在酶解溫度為30 ℃，酶的添加量為0.1%，酶解時間為4 h 的固定條件下，考察預糊化時間（3、6、9、12 min）對處理糙米蒸煮時間的影響；在酶解時間為4 h，酶的添加量為0.1%，預糊化時間為9 min 的固定條件下，考察酶解溫度（20、30、40、50 ℃）對處理糙米蒸煮時間的影響。

1.2.4 酶解輔助預糊化響應面試驗設計 利用Design-Expert 8.0.5 軟件自帶的中心組合試驗模型，以酶解時間（A）、酶的添加量（B）、預糊化時間（C）、酶解溫度（D）4 個因素為自變量，糙米處理后蒸煮時間為響應值，依據單因素實驗結果，設計了四因素三水平的響應面分析試驗。利用Design-Expert 8.0.6軟件進行數據擬合，具體因素水平設置表1。

表1 響應面試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.2.5 蒸煮時間的測定 使用玻璃板-白芯法進行米飯蒸煮時間的測定[15]。稱取5 g 樣品，加入到10 mL沸水中進行蒸煮。蒸煮時，每隔2 min 隨機取出10 粒樣品，將其在玻璃板上進行擠壓。樣品擠壓時無不透明白芯出現的時間為蒸煮時間。

1.2.6 揮發性物質的提取與分析

1.2.6.1 樣品準備 6 種待測樣品各稱取20.00 g 于頂空樣品瓶中，用錫紙做隔墊進行加塞密閉處理，于80 ℃的恒溫水浴中平衡1 h，再將萃取頭插入頂空樣品瓶中萃取50 min，之后于GC-IMS 進樣口（250 ℃、不分流模式）解析5 min。

1.2.6.2 GC-IMS 分析條件 糙米頂空瓶中孵化溫度：75 ℃/95 ℃，孵化時間20 min；IMS：遷移譜的溫度45 ℃，GC：柱溫40 ℃。其中采集數據程序設置如表2 所示。

表2 采集數據程序設置Table 2 Collect data application settings

1.3 數據處理

試驗中采用SPSS19.0 進行數據分析，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標準，每個樣品做3 個重復。通過GC-IMS 自帶的IMScontrol TFTP-Server軟件進行三維指紋圖譜的采集，使用 GC-IMS 自帶的LAV 2.0.0 軟件和Matlab 2015b（美國 Mathworks）進行綜合分析。使用LAV 對譜圖進行RIP（Reactive ion peak）標準化處理，依據不同樣品對應的特征峰強度變化，選取26 個特征信息，以特征峰對應的離子強度作為參數變量，使用Matlab 軟件對變量進行統計分析，主要采用主成分分析和線性判別分析兩種方法進行分析處理。GC-IMS 特征峰選取原則：GCIMS 三維譜中每一個特征峰代表一種揮發性有機成分，以不同樣品中的特征峰的有無或者特征峰強度的顯著變化為原則，手動選擇并以長方形標記特征峰所在區域，以該特征峰區域的峰強度（即特征區域離子強度的最大值）作為參數變量進一步做數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

如圖1A 所示，隨著酶解時間的延長，糙米蒸煮時間呈現先下降后上升的趨勢，在酶解4 h 時蒸煮時間最短。其原因可能是隨酶解時間的延長，糙米皮層的致密結構不斷被破壞，有利于糙米蒸煮時間降低。但繼續延長酶解時間卻使糙米的蒸煮時間增加，可能是因為酶解液隨著酶解時間的延長，組分越來越復雜，不僅降低酶活性限制酶解反應，而且皮層結構破壞程度越大越有利于酶解液中的小分子與糙米中成分反應，限制糙米糊化，從而使糙米的蒸煮時間增加。這說明繼續增加水解時間不能提高酶解效率，故酶解時間選為4 h。

圖1B 顯示了酶的添加量對糙米蒸煮時間的影響規律，隨著酶的添加量的增加，糙米蒸煮時間呈先下降后上升的趨勢。酶的添加量低時，酶解速率較慢，皮層降解程度低，蒸煮時水分進入糙米較慢。隨著酶的添加量的增加酶解速率增大，皮層降解程度加大，水分更容易與淀粉作用糊化，使糙米的蒸煮時間縮短。然而，過高的添加量使底物濃度受到制約，致使反應基本達到平衡或降低，使得蒸煮時間增加。

預糊化時間對糙米蒸煮時間的影響如圖1C 所示，隨著預糊化時間的增加，糙米的蒸煮時間呈顯著的下降趨勢（P＜0.05）。這可能是預糊化過程中的蒸汽處理會對糙米致密的表面糠層結構、內部結構產生較強的破壞作用，且蒸汽處理時間越長，結構破壞越嚴重，有效促進了糙米蒸煮過程中水分的吸收[16]，從而縮短了蒸煮時間。但是，當預糊化時間為12 min 時，糙米飯的爆腰率明顯增多，所以預糊化時間選為9 min。

酶解溫度對糙米蒸煮時間影響如圖1D 所示，隨著酶解溫度的升高，糙米的蒸煮時間不斷降低，且降低趨勢明顯，在40 ℃時達到最低。這是因為隨著溫度的升高纖維素酶的活性提高，糙米皮層降解吸水速率加快，蒸煮時促進糙米吸水糊化，使糙米蒸煮時間降低。

圖1 酶解時間（A）、酶的添加量（B）、預糊化時間（C）、酶解溫度（D）對糙米蒸煮時間的影響Fig.1 Effect of processing time(A),enzyme addition(B),steaming time(C) and temperature(D) on the cooking time of brown rice

2.2 響應面法優化酶解輔助預糊化糙米加工工藝

2.2.1 響應面試驗結果 根據單因素實驗的結果，以酶解時間、酶解溫度、酶的添加量和預糊化時間為變量因素，蒸煮時間為響應值，采用 Box-Benhnken 法進行響應面分析，實驗結果見表3。

表3 中心組合實驗設計及結果Table 3 Central composite design and results

對實驗方案得出的29 組數據進行多元回歸擬合，得到以酶解輔助預糊化糙米的蒸煮時間為目標函數的響應面回歸方程為：

從表4 可以看出，蒸煮時間的回歸模型P值小于0.0001，說明回歸模型達到極顯著水平。酶解時間和預糊化時間兩個因素的單次項對蒸煮時間影響有極顯著水平且P＜0.01；酶的添加量和酶解溫度兩個因素的單次項對蒸煮時間影響顯著（P＜0.05）。而酶的添加量、酶解時間、酶解溫度和預糊化時間4 個因素的各平方項對蒸煮時間的影響均有極顯著水平（P＜0.01），而交互項中除了酶的添加量和預糊化時間交互項對響應值的影響顯著外（P＜0.05），其它交互項均不顯著。在所選的各因素水平范圍內，按照對蒸煮時間結果的影響排序為：C＞A＞B＞D，即預糊化時間＞酶解時間＞酶的添加量＞酶解溫度。失擬系數0.6157，達到非顯著水平，說明模型合適；蒸煮時間的決定系數R2分別為0.9514。說明了方程擬合度較高，即方程中自變量的變化可以很好地解釋因變量Y 的變化。

表4 回歸方程方差分析表Table 4 Analysis of variance (ANOVA) of regression equations

酶的添加量、酶解時間、酶解溫度和預糊化時間交互作用對蒸煮時間的影響結果見圖2。從圖2 可以看出，在恒定因素條件為酶解溫度為40 ℃、酶的添加量0.1%、酶解時間4 h 和預糊化時間9 min 的條件下，酶的添加量與預糊化時間交互作用均為顯著（P＜0.05）。隨著酶的添加量和預糊化時間的增加，酶解輔助預糊化糙米的蒸煮時間呈均先下降后上升；而酶解時間與酶的添加量、酶解時間與預糊化時間、酶解時間與酶解溫度的交互作用、預糊化時間與酶解溫度及酶的添加量與酶解溫度交互作用均不顯著（P＞0.05）。這五種交互條件下隨著酶解時間、酶的添加量、預糊化時間和酶解溫度的增加，糙米的蒸煮時間均先下降后上升。

圖2 各因素交互作用對糙米蒸煮時間影響的響應面圖Fig.2 Response surface plots for the effects of different factors onthe cooking time of brown rice

2.2.2 優化工藝的確定及驗證 分析回歸模型可獲取響應值蒸煮時間的極值點，即獲得優化后的最佳工藝參數：酶解時間4.15 h、酶的添加量為0.1%、預糊化時間為9.5 min 和酶解溫度為39.14 ℃時，此時模型預測蒸煮時間的值為21.43 min。根據實際可操作性，按酶解時間4 h、酶的添加量為0.1%、預糊化時間為10 min 和酶解溫度為39 ℃的條件開展三次平行驗證試驗，所得蒸煮時間平均值為（21.56±0.23）min，與模型預測值的誤差在5%以內，說明采用響應面法優化所得工藝參數較為準確可靠。

2.3 糙米中揮發性成分的GC-IMS 測定結果

根據揮發性成分氣相色譜保留時間和離子遷移時間對樣品揮發性組分進行定性分析，確定了58 種揮發性物質的化學成分見表5。這58 種物質主要是醛類、酯類、醇類、酮類、雜環類化合物、酸類及醚類等，與糙米揮發性成分組成的相關報道一致[17-18]。采用GC-IMS Library Search 軟件內置的2014NIST數據庫和IMS 數據庫對6 種樣品的風味物質進行定性分析，在酶解輔助預糊化糙米中檢測到56 種揮發性物質，其中醛類19 種，酮類8 種，酯類6 種，醇類12 種及其它類11 種；而蒸煮后的酶解輔助預糊化糙米中檢測到44 種揮發性物質，其中醛類18 種，酮類8 種，酯類3 種，醇類11 種及其它類4 種。

表5 不同樣品揮發性物質種類及峰強度信息Table 5 Volatile substance types and peak strength information of different samples

續表 5

醛類是本實驗樣品中檢出種類數最多的揮發性物質，其中，未蒸煮樣品中檢出19 種，蒸煮樣品中檢出18 種，結果見圖3。醛類化合物閾值一般較低，又具有疊加效應，往往在食品風味中起重要作用[19]。酶解輔助預糊化糙米（CHLXM）中的2-辛烯醛、3-甲基丁醛和糠醛含量相對較高，且可分別產生青草香、麥芽香和甜杏仁味，對CHLXM 的整體愉悅氣味有較大貢獻。

圖3 蒸煮與未蒸煮樣品中醛類物質的氣味指紋圖譜Fig.3 Major volatile components of aldehydes in cooked and uncooked samples

CHLXM 經蒸煮之后（CHLXM-ZHS），醛類物質的含量有所增加，其中包括苯甲醛、己醛、辛醛、庚醛、2-辛烯醛、2-庚烯醛和癸醛。其中，2-庚烯醛和2-辛烯醛等醛類物質是煮制溫度達到一定條件才檢測到，預測其原因是蒸煮達到了反應所需條件。大量醛類化合物的產生是因為在風味形成的過程中，當美拉德反應生成含有羰基的戊糖和丁糖時，進一步發生Strecker 降解反應也可產生醛類[20]，如苯甲醛是苯丙氨酸的降解產物[21]。

如圖4 所示，CHLXM 中的酮類化合物主要有苯乙酮、丙酮和2-丁酮，經蒸煮之后形成的CHLXMZHS 樣品中，丙酮和2-丁酮的含量均有所增加，說明蒸煮激活了糙米胚中丙酮酸轉氨酶的活力和脂肪酸的氧化作用。酮類閾值一般高于醛類，但性質較穩定、香氣持久，又具有獨特的清香、水果香、花香和甜味等令人愉悅的風味，不僅是樣品中其它雜環類風味物質的中間體，而且對風味物質的構成起到一定的協同作用[14]。

圖4 蒸煮與未蒸煮樣品中酮類物質的氣味指紋圖譜Fig.4 Major volatile components of ketones in cooked and uncooked samples

通常酯類由低級飽和脂肪酸與醇類化合而成，具有令人愉快的水果香氣或酒香味。未蒸煮樣品中的酯類物質共檢出6 種，蒸煮樣品中檢出3 種。如圖5 所示，酶解輔助預糊化技術對糙米酯類物質的含量影響較大，且蒸煮之后的CHLXM 的酯類物質種類減少。酶解輔助預糊化技術和蒸煮處理中都有加熱這一工序，所以推測酯類物質受熱易分解。總之，酯類物質在CHLXM 和CHLXM-ZHS 中的貢獻較小。

圖5 蒸煮與未蒸煮樣品中酯類物質的氣味指紋圖譜Fig.5 Major volatile components of esters in cooked and uncooked samples

大數的支鏈醇來自氨基酸的Strecker 的降解，而多數的直鏈醇來自不飽和脂肪酸的氧化降解[22]。如圖6 所示，2-己醇在CHLXM 中含量最高，而CHLXM-ZHS 中含量較高的醇類物質有甲醇和2-己烯-1-醇。這也說明熱處理有利于醇類風味物質的形成[18]，其中，不飽和醇比飽和醇的氣味強烈，且閾值較低。而酶解輔助預糊化糙米經蒸煮之后2-己烯-1-醇的含量增加，以致果香味增強。飽和醇中：C1～C3香氣輕快；C7～C10芳香氣味；C10以上，氣味逐漸減弱至無味。所以醇類物質對樣品整體風味的和諧有一定的貢獻，有助于提升整體風味。

圖6 蒸煮與未蒸煮樣品中醇類物質的氣味指紋圖譜Fig.6 Major volatile components of alcohols in cooked and uncooked samples

如圖7 所示，與CHLX 和CK 相比，CHLXM 中產生的酸類揮發性物質含量較高，而且CHLXMZHS 中的酸類物質消失。酸類物質閾值較高，對樣品香味的直接貢獻不大，但具有調節體系口感和維持酯類物質香氣的作用[17]。此外，本實驗還檢出少量的雜環類和烷烴類等化合物，一般認為其存在不僅對產品整體風味的和諧有一定的貢獻，而且也是形成雜環化合物的重要中間體，有助于提升整體風味。

圖7 蒸煮與未蒸煮樣品中其它類物質的氣味指紋圖譜Fig.7 Major volatile components of other substances in cooked and uncooked samples

基于以上分析可知，在糙米經酶解輔助預糊化處理過程中，相較于糙米（CHLX）和白米（CK），揮發性物質的種類并沒有減少。其中含量明顯增加的風味物質有苯乙醛、戊醛、3-甲基丁醛和酸類物質，明顯減少的風味物質的含量與白米（CK）相近，如乙酸己酯、蘑菇醇、正戊基呋喃、戊醛、辛醛與庚醛等。而CHLXM-ZHS 與CHLXM 相比，風味物質的種類減少了13 種，包括辛烯醛、苯乙醛、苯乙酮、γ-丁內酯、二甲苯、戊酸、己酸和丁酸等，風味物質含量增加的有正戊基呋喃、2-己烯-1-醇、丙酮、己酮、辛酮和庚醛等。風味物質含量增加的主要原因是前體物質含量隨著煮制溫度升高而增加直到達到了風味物質產生所需條件而被分解氧化[23]。而含量下降是風味前體物質已基本被反應等多種可能因素導致的。在酶解輔助預糊化處理和煮制過程中，酮類，醇類和酸類物質含量均有所變化，這是因為部分酮、醇、酸類是形成雜環類化合物或其他風味物質的重要中間體[19]，并對其它風味化合物起到一定的協同作用。在酶解輔助預糊化技術和煮制過程中，既有美拉德反應及與其相關的Strecker 降解反應，也有脂肪的氧化降解反應。如圖3～圖7 所示，糙米的關鍵風味物質主要是醛類物質，其次是醇類物質和酮類物質，崔琳琳等[24]也給出過相似的研究結果。Champagne 等[25]究發現，米飯風味主要以醛類、醇類、酮類及呋喃類物質為主。Zeng 等[26]的研究證實，在其鑒定出的45 種米飯風味化合物中，醛類所占比重最大，其次是醇類及酮類物質。

2.4 揮發性成分主成分分析（PCA）

用SPSS 軟件對的揮發性物質進行主成分分析（PCA）。主成分分析是設法將原來眾多具有一定相關性的幾個指標，重新組合成一組新的互相無關的綜合指標來代替原來的指標，以評價原來變量的信息。在PCA 主成分分析圖中，距離越遠的兩組差異越大，距離越近的兩組差異越小。由表6 可知第一主成分的貢獻率為91.928%，第二主成分的貢獻率為4.998%，累計貢獻率為96.926%，累計貢獻率大于80%可以進行PCA 分析[27]。利用Origin 軟件制作PCA 圖，結果如圖8 所示。可以看出蒸煮前后的白米、糙米和酶解輔助預糊化糙米的主成分有明顯差異，可將白米、糙米、酶解輔助預糊化糙米及蒸煮后的白米、糙米、酶解輔助預糊化糙米區分開。

表6 解釋的總方差Table 6 Total variance explained

圖8 樣品揮發性風味物質的PCA 分析圖Fig.8 PCA analysis of the sample with uncooked volatile flavor

3 結論

利用響應面試驗對糙米的酶解輔助預糊化條件進行優化，得到最佳酶解輔助預糊化工藝條件：酶解時間為4 h、酶的添加量為0.1%、預糊化時間為10 min和酶解溫度為39 ℃，在此條件下生產的糙米蒸煮時間短且糠味不明顯。用氣相色譜-離子遷移譜法（GC-IMS）測定白米、糙米和酶解輔助預糊化糙米及其蒸煮前后的揮發性物質，在酶解輔助預糊化糙米中檢測到56 種揮發性物質，其中醛類19 種，酮類8 種，酯類6 種，醇類12 種及其它類11 種；而蒸煮后的酶解輔助預糊化糙米中檢測到44 種揮發性物質，其中醛類18 種，酮類8 種，酯類3 種，醇類11 種及其它類4 種。糙米酶解輔助預糊化前、后揮發性風味成分改變最大的為醛類、酮類和醇類；而酶解輔助預糊化糙米蒸煮前、后揮發性風味成分改變最大的為酯類和其它類中的酸類，這是因為酶解輔助預糊化和蒸煮過程中，糙米中的糖類、核苷酸、自由氨基酸、肽類等發生美拉德反應[28-29]，從而產生醛類、呋喃衍生物、酮類、吡嗪類等揮發性風味物質[30-31]。