幽門螺桿菌鞭毛蛋白A單克隆抗體的制備與鑒定

邱 席，劉 偉，莊睿娟，陳亞瓊，鄧晨希，王團(tuán)老*

(1.廈門大學(xué)藥學(xué)院，福建 廈門 361102；2.廈門大學(xué)國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361102)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)在人類胃中定植，與胃炎、胃潰瘍和十二指腸潰瘍以及胃癌密切相關(guān)[1-2].1994年，國際癌癥研究機構(gòu)已將其列為第一類致癌因子[3].然而，目前臨床上對于幽門螺桿菌的診斷方法并不理想，本研究旨在探索更好的診斷方法.

幽門螺桿菌的鞭毛伸出菌體外約2.5 μm，鞭毛自細(xì)胞膜長出后，游離于細(xì)胞膜外；伸出菌體外的鞭毛主要為鞭毛鞘包裹的鞭毛絲，由鞭毛蛋白A(FlaA)和FlaB二聚體組成，其中FlaA是主要的鞭毛蛋白[4].FlaA核苷酸序列高度保守，不同幽門螺桿菌的FlaA核苷酸序列同源性可達(dá)90%以上[5],且具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性.綜上特點，本研究選擇幽門螺桿菌的FlaA為抗原，通過傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)制備其單克隆抗體(mAb)，并對其特性進(jìn)行鑒定，以期為建立新的幽門螺桿菌檢測技術(shù)提供實驗參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

限制性內(nèi)切酶SacⅠ、XholⅠ和T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒均購自上海生工生物工程股份有限公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21菌株、骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag14和載體PET-28a為本實驗室保存；6～8周齡雌性BALB/c小鼠(SPF級)由廈門大學(xué)實驗動物中心提供；弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、次黃嘌呤、胸腺嘧啶、氨基蝶呤和聚乙二醇(PEG1500)購自Sigma公司；胎牛血清和小牛血清購自Hyclone公司；RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和卡那霉素購自Biosharp公司，考馬斯亮藍(lán)購自麥克林公司，尿素購自西隴化工公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 抗原的制備

1) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)在NCBI數(shù)據(jù)庫(http:∥ncbi.nlm.nih.gov)中查到的HpFlaA基因序列，設(shè)計引物并委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行合成.按照KOD(TOYOBO公司)高保真PCR體系50 μL，引物10 mmol,幽門螺桿菌基因組DNA(ATCC)模板200 ng.PCR程序：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s,68 ℃ 45 s,72 ℃ 10 min,35個循環(huán)4 ℃ 10 min.通過SacⅠ與XholⅠ雙位點酶切，并通過T4連接酶將目的片段與載體PET-28a重組.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落并擴大培養(yǎng)，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒；并用SacⅠ與XholⅠ限制性內(nèi)切酶，37 ℃ 酶切1 h,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗.

2) 蛋白的表達(dá)、純化與復(fù)性：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布于卡那霉素抗性的LB平板，37 ℃培養(yǎng)箱中過夜，挑取單菌落置于5 mL卡那霉素抗性培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)后離心收菌；十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后考馬斯亮藍(lán)染色，脫色.挑陽性菌落，擴增至2瓶800 mL卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)后8 000 r/min、4 ℃離心10 min收菌并超聲破碎(功率200 W，工作3 s，間歇6 s，共10 min)；取上清和少許沉淀經(jīng)SDS-PAGE驗證蛋白表達(dá)位置.用2 mol/L尿素洗滌沉淀2次，然后用8 mol/L 尿素溶解，4 ℃梯度透析復(fù)性.

1.2.2 mAb的制備

1) 小鼠的免疫：將純化的HpFlaA融合蛋白與等體積的FCA充分乳化，BALB/c小鼠四肢及背部皮下多點注射融合蛋白50 μg/只.2周后進(jìn)行第2次免疫，將純化的HpFlaA融合蛋白與等體積的FIA充分混合，四肢及背部皮下多點注射加強免疫，2周后第3次免疫，同第2次.第3次免疫后7～10 d,眼球取血,通過間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定血清抗體效價.于融合前3 d選擇抗體滴度最高的1只小鼠脾臟加強免疫100 μg.

2) 細(xì)胞融合：在融合之前準(zhǔn)備飼養(yǎng)層細(xì)胞，取1只13 d左右小鼠的胸腺和1只8周小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞.脾臟免疫3 d后，無菌取脾臟制成單細(xì)胞懸液，與生長狀態(tài)良好的SP2/0-Ag14細(xì)胞融合，采用常規(guī)PEG促融合方法，融合后的細(xì)胞接種于96孔板，置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

3) ELISA和雜交瘤細(xì)胞的篩選：將0.5 μg/mL的抗原包被96孔酶標(biāo)板，以融合10 d后雜交瘤細(xì)胞的上清為一抗，以SP2/0-Ag14細(xì)胞上清為陰性對照，以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗.測定雜交瘤細(xì)胞上清的450 nm吸光度(A450)值(P)和SP2/0-Ag14細(xì)胞上清的A450值(N)，P/N≥2.1為陽性.將陽性孔中細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋克隆化，直至出現(xiàn)陽性單克隆，擴大培養(yǎng)并及時凍存.

4) 腹水的制備和抗體的純化：BALB/c小鼠腹腔注射500 μL無菌液體石蠟，10 d后，接種雜交瘤細(xì)胞1×106～2×106個/只，待小鼠腹部明顯膨脹，抽取腹水，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清.0.45 μm濾器(Millipore公司)過濾，將過濾后的腹水用Protein G進(jìn)行純化，純化后經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)4 ℃ 透析后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定.

1.2.3 mAb的特性鑒定

1) 亞型的鑒定：根據(jù)mAb亞型檢測試劑盒(Thermo Scientific 公司)說明書對抗體進(jìn)行分型.

2) 用間接ELISA方法計算親和常數(shù).以0.5(Ag)和1.0(Ag′) μg/mL的抗原質(zhì)量濃度包被酶標(biāo)板，將抗體倍比稀釋，以抗體濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)作圖，曲線出現(xiàn)平臺期時表示抗原被全部結(jié)合，以此時的A450值為100%，找出50%對應(yīng)的A450值，代入公式，即可得親和常數(shù)[6]:

式中c(Ag)和c(Ag′)為不同的包被抗原濃度，c(Ab)和c(Ab′)為對應(yīng)的mAb濃度.

3) 效價檢測：對純化后的抗體用間接ELISA方法檢測效價，設(shè)置陰性對照，P/N≥2.1的最高抗體稀釋倍數(shù)即為抗體效價.

4) 蛋白免疫印記(Western blot)鑒定mAb特異性：將實驗室自制的His標(biāo)簽蛋白和HpFlaA蛋白在95 ℃變性5 min后進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE檢測.220 mA恒流，55 min轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的牛奶(PBS+0.1%(體積分?jǐn)?shù))Tween-20，即PBST配制)封閉1 h；用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的BSA稀釋mAb和His標(biāo)簽抗體，室溫孵育1 h，PBST洗3次，每次7 min；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗用PBST按1∶5 000 稀釋，室溫孵育1 h，PBST洗3次，每次7 min，使用化學(xué)發(fā)光液顯色.

5) 樣本的來源和處理：臨床樣本為患者的糞便，由北京新興四寰生物技術(shù)有限公司篩選提供.其中5份陽性樣本(3份弱陽性“+”、1份較強陽性“++”、1份強陽性“+++”和3份陰性“—”樣本).用天平稱取相同量樣本，用PBS溶解，作為抗原.

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原的制備

2.1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)目的片段的基因序列設(shè)計引物，通過PCR擴增得到1 300 bp左右的基因片段(圖1(a))，與預(yù)期相符.將重組質(zhì)粒PET-28a-HpflaA經(jīng)SacⅠ和XholⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后(圖1(b))得到1 300 bp左右的片段，與PCR結(jié)果相符，為目的基因片段，且測序結(jié)果正確，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

圖1 重組質(zhì)粒PET-28a-HpflaA的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant plasmid PET-28a-HpflaA

2.1.2 重組蛋白的表達(dá)純化

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)，涂板，挑取單菌落進(jìn)行IPTG小量誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果顯示在約54 ku處有一條清晰條帶(未誘導(dǎo)則無此條帶).隨后將陽性菌落大量擴增，經(jīng)超聲破碎、離心獲得裂解液、上清和沉淀，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定(圖2(a))，結(jié)果顯示蛋白在沉淀中大量表達(dá).從包涵體中對HpFlaA進(jìn)行純化，以1 μg/μL BSA為對照，純化的HpFlaA抗原質(zhì)量濃度達(dá)到3 μg/μL(圖2(b))，且純化后雜蛋白減少，純度較高，可用于免疫小鼠.

(a)重組蛋白可溶性鑒定，M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(下同)，1.上清,2.沉淀,3.全菌體；(b)純化后重組蛋白的濃度測定.圖2 重組蛋白的表達(dá)與鑒定Fig.2 Expression and identification of recombinant protein

2.2 mAb的制備和鑒定

2.2.1 單克隆雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建與篩選

小鼠免疫3次后，眼眥取血，以未免疫小鼠的血清為陰性對照，間接ELISA法測定小鼠血清效價.選用效價最高的小鼠進(jìn)行脾臟加強免疫，并進(jìn)行細(xì)胞融合.細(xì)胞融合后10 d左右，取細(xì)胞上清，通過間接ELISA法進(jìn)行融合檢測,共得到196個陽性孔.由于此時所得陽性孔中的細(xì)胞并不是由同一雜交瘤細(xì)胞增殖而來，所以為了得到單克隆細(xì)胞需要對陽性孔進(jìn)行有限稀釋克隆化，共6輪，得到5株單克隆雜交瘤細(xì)胞(2G2、2G10、3E2、3E4和4H3).取這5株雜交瘤細(xì)胞的上清進(jìn)行ELISA驗證，以SP2/0-Ag14細(xì)胞上清為陰性對照(NC).圖3表明這5株雜交瘤細(xì)胞都能穩(wěn)定分泌HpFlaA抗體.

圖3 間接ELISA篩選雜交瘤細(xì)胞株Fig.3 Screening of hybridoma cell lines by indirect ELISA

2.2.2 抗體的分型

抗體的分型結(jié)果決定單抗后續(xù)的純化和應(yīng)用方法.收集雜交瘤細(xì)胞上清，根據(jù)mAb亞型ELISA檢測試劑盒說明書，對抗體進(jìn)行分型；并以HRP標(biāo)記的鼠抗(GAM-HRP)為陽性對照，在酶標(biāo)儀上測定各孔的A450值，結(jié)果如表1所示，可見5株雜交瘤細(xì)胞的mAb均為IgG1型.

表1 mAb的亞型鑒定Tab.1 Subtype identification of mAb

2.2.3 腹水的制備與純化

采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法大量制備抗體，并用Protein G層析介質(zhì)進(jìn)行純化.純化后的抗體經(jīng)SDS-PAGE后用考馬斯亮藍(lán)染色、脫色，結(jié)果顯示獲得5株高純度的mAb(圖4).純化后抗體的質(zhì)量濃度測定結(jié)果如下：2G2為4.9 mg/mL，2G10為5.1 mg/mL，3E2為0.95 mg/mL，3E4為5.1 mg/mL，4H3為3.5 mg/mL.從SDS-PAGE結(jié)果(圖4)可以看出mAb的重鏈約為54 ku，輕鏈約為26 ku.每個抗體有兩條重鏈和兩條輕鏈，因此mAb的分子質(zhì)量約為160 ku.

圖4 SDS-PAGE檢測純化后mAb的純度Fig.4 The purity of purified mAb identified by SDS-PAGE

2.2.4 抗體的親和常數(shù)測定

通過間接ELISA法得到mAb的親和曲線(以2G2為例，如圖5所示)，在曲線上找出50%的A450值，代入公式得到2G2、2G10、3E2、3E4和4H3的親和常數(shù)Ka分別為2.7×107，1.7×108，8.0×107，1.1×108和1.1×108L/mol.5株雜交瘤細(xì)胞的mAb的親和常數(shù)均大于107，表明上述mAb的親和力較高.

圖5 間接ELISA測定2G2 mAb的親和曲線Fig.5 Affinity curves of the 2G2 mAb detected by indirect ELISA

2.2.5 抗體的效價檢測

對純化后的抗體用間接ELISA方法檢測效價，設(shè)置陰性對照(NC)，結(jié)果如圖6所示:2G2、2G10、3E2、3E4和4H3的效價分別為1∶128 000，1∶1 024 000，1∶512 000，1∶512 000和1∶1 024 000，其中2G10和4H3的效價最高.

圖6 純化后mAb的效價Fig.6 Titers of purified mAb

2.2.6 抗體的特異性檢測

采用間接ELISA和Western blot同時驗證抗體的特異性.將實驗室自制的His標(biāo)簽蛋白(His-protein，作為對照)和HpFlaA同時包被酶標(biāo)板(0.5 μg/mL)，以5株雜交瘤細(xì)胞的mAb為一抗，結(jié)果如圖7(a)所示，mAb只能和HpFlaA反應(yīng).同時以His標(biāo)簽抗體和5株雜交瘤細(xì)胞的mAb為一抗，進(jìn)行Western blot驗證，如圖7(b)所示,5株雜交瘤細(xì)胞的mAb均不與自制的His標(biāo)簽蛋白反應(yīng)，僅特異性地識別目標(biāo)蛋白，與間接ELISA結(jié)果相同.

圖7 mAb的特異性檢測Fig.7 Specificity detection of mAb

2.2.7 雙抗夾心ELISA的初步建立

采用棋盤法將5株mAb分別作為包被抗體，其對應(yīng)的標(biāo)記生物素(Bio-)的抗體作為檢測抗體，進(jìn)行配對篩選.結(jié)果如表2所示，可知2G2-2G10、2G2-3E4、2G2-4H3、2G10-2G10、3E4-3E4和3E4-4H3為陽性配對.其中2G2-3E4的反應(yīng)值稍高于其他配對，但仍不理想，因此后續(xù)需要對此體系進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到較好的準(zhǔn)確度和靈敏度.

表2 雙抗體夾心ELISA配對篩選Tab.2 Pairwise screening bydouble antibody sandwich ELISA

2.2.8 雙抗體夾心ELISA檢測臨床樣本

采用上述雙抗體夾心ELISA法中配對效果最好的一組2G2-3E4(以2G2為包被抗體，以3E4為檢測抗體)檢測臨床樣本，結(jié)果如表3所示.雖然3份弱陽性樣本中出現(xiàn)了一份漏檢，但是3份陰性樣本(6～8)的檢測結(jié)果均正確，未出現(xiàn)假陽性；較強和強陽性樣本的檢測結(jié)果均正確.由此初步斷定所建立的雙抗體夾心ELISA體系可以用于檢測臨床樣本.

表3 雙抗體夾心ELISA檢測臨床樣本Tab.3 Clinical sample detection bydouble antibody sandwich ELISA

3 討 論

目前，對于幽門螺桿菌感染的診斷方法依據(jù)是否依賴胃鏡檢查分為兩類：一類是依賴于胃鏡活檢的侵襲性檢查法，包括快速尿素酶實驗、胃黏膜直接涂片染色鏡檢、基因檢測方法等，缺點是胃鏡檢查操作繁瑣，對患者造成疼痛，不適合兒童和妊娠期婦女；另一類是不依賴于胃鏡活檢的非侵襲性檢查法，包括13/14C呼氣試驗，15N-氮排除實驗，免疫學(xué)血清抗體測定等，13/14C呼氣試驗在臨床上應(yīng)用普遍，優(yōu)點是準(zhǔn)確率較高，但缺點是價格昂貴或伴有放射性污染.免疫學(xué)血清抗體測定檢測特異性較高，但患者并不是在感染幽門螺桿菌后體內(nèi)立刻出現(xiàn)特異性抗體，而且在幽門螺桿菌根除后抗體仍然可以存在幾個月甚至一年，還存在交叉反應(yīng)性抗體[7-8].侵襲性和非侵襲性檢查法對于感染幽門螺桿菌的診斷都不讓人十分滿意，而近年來發(fā)現(xiàn)檢測糞抗原技術(shù)是一種價格低廉、安全、準(zhǔn)確、患者依從性好的診斷方法[8].幽門螺桿菌定植在人胃黏膜上皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞脫落時會攜帶含幽門螺桿菌抗原的幽門螺桿菌代謝產(chǎn)物，與死亡菌體一起通過糞便排出體外[9]，因此可通過檢測糞幽門螺桿菌抗原推斷患者是否感染幽門螺桿菌.幽門螺桿菌的毒力因子主要有尿素酶、鞭毛、黏附素、熱休克蛋白、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白 A 和空泡毒素等[10-11].目前已有研究成功制備出幽門螺桿菌全菌體、UreB、HpaA和空泡毒素等重要毒力因子的mAb，而本研究成功制備出FlaA的mAb，因此可以通過將幽門螺桿菌不同毒力因子的mAb以及全菌蛋白的mAb同時檢測臨床糞便樣本，進(jìn)而比較出檢測效果、準(zhǔn)確度、靈敏度俱佳的mAb，以建立更準(zhǔn)確、迅速、靈敏的糞抗原檢測方法.然而由于糞便成分比較復(fù)雜[12-13]，且不同患者糞便中幽門螺桿菌抗原成分的量也有差異，而幽門螺桿菌的不同抗原成分的mAb在檢測時可以互為補充，以最大限度地降低臨床上對幽門螺桿菌感染者的漏檢率，大大提高診斷幽門螺桿菌感染的準(zhǔn)確率，預(yù)防由于幽門螺桿菌感染所誘發(fā)的疾病,有較好的應(yīng)用前景.

本研究成功構(gòu)建了PET-28a-HpflaA重組表達(dá)質(zhì)粒，通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出HpFlaA融合蛋白.以純化的融合蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，通過傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)成功制備出5株能穩(wěn)定分泌抗HpFlaA的mAb的雜交瘤細(xì)胞株.對純化后的mAb進(jìn)行性質(zhì)鑒定，結(jié)果表明抗體具有純度好、親和力高、特異性好、效價高的特點.本研究還將5株mAb通過棋盤法進(jìn)行配對，以建立較好的雙抗夾心ELISA檢測體系，結(jié)果表明以2G2為包被抗體，以3E4為檢測抗體的檢測體系反應(yīng)值較高，并用此體系檢測8份臨床樣本發(fā)現(xiàn)陰性、較強陽性和強陽性樣本的檢測結(jié)果均正確，但3份弱陽性樣本中卻出現(xiàn)了一份漏檢和一份不確定結(jié)果，推測可能是因為所建立的雙抗夾心檢測方法準(zhǔn)確度較好，但靈敏度還存在缺陷，在檢測弱陽性樣本時由于其中所含HpFlaA抗原較少，未達(dá)到檢測體系的檢測下限，所以出現(xiàn)漏檢.

后續(xù)需要進(jìn)一步優(yōu)化2G2-3E4雙抗夾心ELISA體系，以達(dá)到更高的靈敏度，降低檢測下限，從而降低漏檢率，再用優(yōu)化后的體系檢測大量的臨床樣本，進(jìn)一步驗證其準(zhǔn)確性和靈敏度,為HpFlaA檢測試劑盒的制備奠定實驗基礎(chǔ).

致謝：感謝北京新興四寰生物技術(shù)有限公司在臨床樣本檢測過程中提供的幫助.