衍生化及非衍生化串聯質譜法在遺傳代謝疾病篩查及診斷中的應用及比較*

丁 麗，張 瑞

空軍軍醫大學第一附屬醫院檢驗科，陜西西安 710032

在過去，遺傳代謝病的診斷和治療絕大多數依賴于醫師的臨床經驗和一些非特異的生化指標,臨床醫生往往難以作出具體病因診斷[1]。隨著臨床診斷學的不斷發展，尤其是高效液相色譜-串聯質譜技術應用于臨床檢驗的快速發展，這種局面已經改觀[2]。該技術可在幾分鐘內同時進行數十種代謝物的分析,對包括氨基酸、有機酸、脂肪酸氧化代謝紊亂在內的多種遺傳代謝性疾病進行篩查[3-4]。目前高效液相色譜-串聯質譜用于遺傳代謝病篩查的方法有衍生化和非衍生化串聯質譜法兩種[5]，本文比較了衍生化和非衍生化串聯質譜法的差異。

1 資料與方法

1.1一般資料 將本院2016年5月至2017年12月采集的健康新生兒和兒童干血斑標本共1 060例(主要來自西部地區,兒童：男230例、女225例，共455例；新生兒：男309例、女296例,共605例)用于參考值范圍考察。從中隨機選取310例標本用于方法一致性考察。另外選取同期于本院確診的7例苯丙酮尿癥患兒干血斑標本用于考察衍生化和非衍生化串聯質譜法的臨床應用情況。

1.2儀器與試劑 儀器： API3200串聯質譜儀購于美國AB生物應用系統公司,高效液相色譜儀購于美國安捷侖公司 (Agilent 1200型)，96孔板加熱吹干裝置購于杭州奧盛公司(MD200型)，加熱振蕩儀購于Thermo Scientific公司(Iems Incubator/Shaker HT220-240V型)。試劑：甲醇、正丁醇、乙酰氯、乙腈等試劑購于Thermo Scientific公司，均為色譜級。將正丁醇和乙酰氯按體積比9∶1配制成3 mol/L的鹽酸正丁醇溶液作為衍生化試劑備用,96孔聚丙烯板購于博奧公司。實驗中所用氮氣的純度為99.9%以上。9種氨基酸內標物和9種酰基肉堿內標物均用甲醇溶解并稀釋配制成萃取液,保存于4 ℃條件下,于1個月內用完。

1.3方法

1.3.1干血斑標本的制備與保存 兒童干血斑標本：于上午7-9時采集空腹兒童末梢血滴于專用采血濾紙上，形成幾個均勻血斑,完全滲透，待自然晾干后，封于塑料袋內，-20 ℃冰箱保存待檢；新生兒干血斑標本：新生兒出生3 d后，哺乳多次，采足后跟血于空白采血濾紙上，完全滲透，待自然晾干后，封于塑料袋內，-20 ℃冰箱保存待檢。

1.3.211種氨基酸和22種酰基肉堿檢測的參考值范圍確定 通過檢測健康新生兒和兒童干血斑標本中的11種氨基酸：丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、瓜氨酸(Cit)、甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、鳥氨酸(Orn)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Try)、纈氨酸(Val)，以及22種酰基肉堿：游離肉堿(C0)、乙酰肉堿(C2)、丙酰肉堿(C3)、丁酰肉堿(C4)、異戊酰肉堿(C5)、己酰肉堿(C6)、辛酰肉堿(C8)、癸酰肉堿(C10)、 十二酰肉堿(C12)、十四酰肉堿(C14)、十六酰肉堿(C16)、十八酰肉堿(C18)、異戊烯酰肉堿(C5:1)、辛烯酰肉堿(C8:1)、癸烯酰肉堿(C10:1)、癸二烯酰肉堿(C10:2)、十二烯酰肉堿(C12:1)、十四烯酰肉堿(C14:1)、十四碳二烯酰肉堿(C14:2)、十六烯酰肉堿(C16:1)、十八碳二烯酰肉堿(C18:2)、十八烯酰肉堿(C18:1)，從而確定本實驗室檢測的參考值范圍上下限。

1.3.3衍生化串聯質譜法 (1)樣品處理：用打孔器在干血片上制直徑3 mm 的圓形血片(4個作為質控品,1個作為空白對照),置于96孔板中,每孔加入萃取液100 μL,室溫密封振蕩15 min以萃取血片中的待測物質,然后轉移萃取液至另一個96孔聚丙烯板,40 ℃加熱并用氮氣吹干,再加入60 mL衍生化試劑,Teflon 膜覆蓋,置于65 ℃恒溫箱內反應20 min,隨后40 ℃加熱并用氮氣吹干,再加入80%乙腈水溶液(乙腈-水體積比為80∶20)100 μL 溶解,鋁膜覆蓋,串聯質譜儀檢測。(2)儀器設置：乙腈作為流動相,設置液相色譜的流速為300 μL/min,進樣量為20 μL，質譜測定中性氨基酸采用中性丟失掃描方式,中性丟失片斷質荷比(m/z)為102,掃描范圍為140～280; Gly、Orn、Arg、Cit采用多反應檢測,每個樣品檢測只需要2 min。(3)定量分析:采用美國AB生物應用系統公司的ChemoView 2.0.2 軟件,由經過衍生化的待測物及其同位素內標物的離子峰強度,計算出所測標本中待測物濃度。

1．4非衍生化串聯質譜法 (1)樣品處理：用打孔器在干血片上制直徑3 mm 的圓形血片，置于96孔板中,每孔內加入含同位素內標物的萃取液100 μL，Teflon膜密封，45 ℃密封振蕩45 min，振蕩頻率650 r/min，萃取血片中的氨基酸和酰基肉堿，轉移至另一個96孔聚丙烯板，鋁膜覆蓋，即可上樣檢測。(2)儀器設置:乙腈作為流動相,設置液相色譜的流速為300 μL/min,進樣量為20 μL，質譜測定中性氨基酸采用中性丟失掃描方式,中性丟失片斷質荷比(m/z)為102,掃描范圍為140～280;Gly、Orn、Arg、Cit采用多反應檢測,每個樣品檢測只需要2 min。(3)定量分析：定量分析采用美國AB生物應用系統公司的ChemoView 2.0.2 軟件,由待測物及其同位素內標的離子峰強度,計算出所測標本中待測物質的濃度。

1.5參考值范圍的確定 計算各指標的P2.5～P97.5，初步建立本實驗室衍生化串聯質譜法和非衍生化串聯質譜法檢測氨基酸和肉堿的參考值范圍。

1.6精密度的評估 分別采用衍生化和非衍生化串聯質譜法檢測低、中、高3種濃度的氨基酸和酰基肉堿樣品，計算批內變異系數(CV批內)和批間變異系數(CV批間)，評估兩種方法的精密度。

1.7方法一致性考察 采用Bland-Altman法評估衍生化和非衍生化串聯質譜法檢測結果的一致性,P<0.05為差異有統計學意義，即方法不一致。

1.8臨床應用 同時運用衍生化串聯質譜法和非衍生化串聯質譜法檢測已經確診的苯丙酮尿癥患兒的氨基酸和酰基肉堿水平來考察兩種方法在臨床應用中的可行性。

2 結 果

2.1兩種方法的參考值范圍 兩種方法的參考值范圍見表1。

2.2兩種方法的精密度評估 非衍生化串聯質譜法的CV批內為2.06%～7.39%，CV批間為3.64%～10.97%；衍生化串聯質譜法的CV批內為4.14%～10.95%，CV批間為6.14%～12.91%。

2.3方法的一致性考察 以Phe檢測結果為代表，見圖1。3.37%的點位于95%一致性界限(LoA)之外；在LoA范圍以內，兩種測量方法差值的平均值為-0.1，接近0，說明兩種方法的測量結果較為接近；P=0.27>0.05，兩種方法檢測的結果差異無統計學意義，具有較好的一致性。

圖1 衍生化與非衍生化串聯質譜法的Bland-Altman分析圖

2．4臨床應用 運用衍生化串聯質譜法和非衍生化串聯質譜法同時檢測7例已經確診的苯丙酮尿癥患兒體內的氨基酸和酰基肉堿水平，7例患兒的Phe水平均高于參考值，而且無論是衍生化還是非衍生化串聯質譜法檢測7例患兒的Phe/Tyr比值均大于3，即陽性檢出率均為100%。

3 討 論

雖然單一病種的遺傳代謝病發病率低，但因其種類繁多，所以總體發病率較高[6-7]。在我國，該疾病的構成中氨基酸代謝異常占了大部分，其次為有機酸代謝異常，脂肪酸氧化代謝障礙最少[8-9]。串聯質譜法用于新生兒遺傳代謝疾病的篩查具有簡便、快速、精準、高效等優點[10-11]，不僅擴展了篩查的疾病譜，也是新生兒疾病診斷中最重要的進展[12-15]。采用衍生化與非衍生化串聯質譜法進行干血斑的氨基酸和酰基肉堿分析均可在2 min內完成檢測,兩種方法的參考值范圍雖略有不同，但均能夠達到較高的精密度,其中非衍生化法簡便易行，標本處理步驟少時間短，精密度更高，但是衍生化法的檢出限更低，更加靈敏，所以衍生化法更適用于低端質譜。本研究采用Bland-Altman法評估了衍生化和非衍生化兩種方法的一致性。以 Phe為代表，結果顯示僅有3.37%的點位于95% LoA之外，96.63%的結果均在LoA范圍以內，兩種測量方法差值的均線值接近0值，兩種方法的檢測結果較為接近，兩種方法具有較好的一致性(P>0.05)。兩種檢測方法對于7例苯丙酮尿癥患兒標本的陽性檢出率均為100%。

綜上所述，在遺傳代謝病篩查的過程中，衍生化串聯質譜法和非衍生化串聯質譜法均可滿足臨床對遺傳代謝疾病篩查及診斷的需要。