WT1、NKD1基因在急性髓系白血病中的表達及其與預后的關(guān)系*

馮硯平，王 楠，王偉佳

廣東省中山市人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，廣東中山 528400

急性髓系白血病是一類高度異質(zhì)性疾病，主要特征為髓系原始細胞克隆性惡性增殖，危害較大，病死率較高。基因檢測有助于預防、避免重大疾病的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)個體基因缺陷，制訂臨床治療方案[1-2]。Wilms基因(WT1基因)最早在Wilms瘤中被發(fā)現(xiàn)，相對分子質(zhì)量約為50×103，位于人類染色體11p13，與瘤體病變密切相關(guān)。WT1基因在白血病中有較高水平的表達，被稱為“泛白血病”基因標志，與白血病發(fā)生、發(fā)展以及預后均密切相關(guān)[3]；裸角質(zhì)膜同源蛋白(NKD1)基因?qū)儆赪nt/β-Catenin信號通路抑制物，與腫瘤細胞的多項生物學功能有關(guān)，也能在正常組織中表達，但表達水平較低[4]。本研究分析了WT1、NKD1基因在急性髓系白血病中的表達情況，旨在探討WT1、NKD1基因表達與急性髓系白血病預后的關(guān)系。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年2月至2019年6月本院收治的100例急性髓系白血病患者納入研究作為觀察組，患者均符合《成人急性髓系白血病中國診療指南(2017年版)》[5]診斷標準。觀察組患者年齡35～72歲，平均(51.68±12.14)歲；男性46例，女性54例；FAB分型：16例M1型，28例M2型，24例M3型，22例M4型，10例M5型；ET0分型：15例突變型，85例野生型；核型：65例t(15；17)型，35例t(8；21)型。另外，選取同期于本院治療的造血系統(tǒng)非惡性腫瘤(缺鐵性貧血)患者100例作為對照組。對照組患者年齡34～71歲，平均(51.49±12.13)歲；男性47例，女性53例。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究已經(jīng)本院倫理委員會批準。納入研究的患者均同意接受12個月隨訪，依從性、配合度較高，已簽署書面知情同意書。排除標準：溝通、交流障礙者；合并惡性腫瘤，預計生存時間≤1個月者。

1.2方法

1.2.1WT1的檢測及分析 (1)抽取受檢者2 mL抗凝骨髓液，分離單個核細胞，PBS洗2遍，吹打懸浮(運用適量PBS)，抽取0.5 mL浸泡于Trizol中搖勻，放于冰箱(-80 ℃)內(nèi)保存；制作2張骨髓涂片。(2)將提取成功的單個核細胞總RNA放入冰箱內(nèi)(-80 ℃)保存。(3)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)：按照說明書配制cDNA反應體系20 μL，PCR擴增反應體系25 μL；WT1基因表達水平以WT1與GAPDH灰度值的比值表示。

1.2.2NKD1的檢測及分析 使用美國ABI公司7300型號熒光定量擴增儀進行反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測，反應體系的配制、反應條件、引物設(shè)計、基因相對表達水平的計算參考文獻[6]。

1.2.3治療方法 對于確診的急性髓系白血病患者，采用柔紅霉素聯(lián)合阿糖胞苷方案(DA方案)進行化療，第1～3天靜脈滴注45 mg/m2柔紅霉素(國藥準字H33020925，瀚暉制藥有限公司)或8 mg/m2去甲氧柔紅霉素(國藥準字H20050145，瀚暉制藥有限公司)，第1～7天靜脈滴注150 mg/m2阿糖胞苷(國藥準字H23021805，國藥一心制藥有限公司)。

1.3觀察指標 比較兩組NKD1、WT1基因表達情況；分析不同性別、年齡、FAB分型、ET0分型、核型的急性髓系白血病患者WT1和NKD1基因表達情況；使用受試者操作特征曲線(ROC曲線)分析WT1、NKD1基因用于急性髓系白血病診斷的價值；對急性髓系白血病患者進行12個月隨訪，統(tǒng)計患者12個月內(nèi)的生存率以及隨訪期間平均生存時間，同時分別統(tǒng)計NKD1、WT1基因不同表達程度(高表達和正常表達)患者的生存率和生存時間；分析WT1、NKD1基因表達與生存時間、生存率的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1兩組間基因表達情況的比較 觀察組WT1基因表達水平(1.13±0.19)高于對照組(0.06±0.01)，差異有統(tǒng)計學意義(t=56.238,P<0.001)；觀察組NKD1基因表達水平(0.86±0.15)高于對照組(0.04±0.01)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

2.2不同臨床特征急性髓系白血病患者的WT1、NKD1基因表達水平 不同性別、年齡、FAB分型、ET0分型、核型的急性髓系白血病患者間比較，WT1和NKD1基因表達水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同臨床特征的急性髓系白血病患者WT1、NKD1基因表達水平的比較

續(xù)表1 不同臨床特征的急性髓系白血病患者WT1、NKD1基因表達水平的比較

2.3WT1、NKD1基因的診斷價值分析 WT1基因檢測以相對表達水平0.88作為診斷界值，>0.88標記為高表達，觀察組100例患者中90例出現(xiàn)高表達。NKD1基因檢測以相對表達水平0.52作為診斷界值，>0.52標記為高表達，觀察組100例患者中92例出現(xiàn)高表達。ROC曲線分析顯示，WT1基因檢測用于急性髓系白血病診斷的AUC為0.979，NKD1基因檢測的AUC為0.984，兩者均具有較高的診斷價值。見表2。

表2 WT1、NKD1基因檢測的ROC曲線分析

2.4患者生存率和生存時間的分析 觀察組100例患者接受化療干預后，總生存率為88.00%(88/100)，平均生存時間為(10.42±2.69)月。不同基因表達程度患者的生存率和生存時間見表3。

表3 對比不同基因表達情況的生存率和生存時間

2.5WT1、NKD1基因表達與急性髓系白血病患者生存時間、生存率的關(guān)系 WT1、NKD1基因表達水平與急性髓系白血病患者生存率無顯著相關(guān)性(P>0.05)，但均與急性髓系白血病患者生存時間呈正相關(guān)(r=0.417、0.492，P<0.001)，WT1基因和NKD1基因表達水平呈正相關(guān)(r=0.643，P<0.001)。

3 討 論

急性髓系白血病是一類高度異質(zhì)性疾病，根據(jù)基因突變和細胞遺傳學情況，可分為3個危險分層，為了準確了解病變發(fā)生、發(fā)展情況，需注重臨床檢測工作，從而合理制訂治療方案[7-8]。WT1是一種抑癌基因，編碼產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄因子，最早從Wilms瘤細胞中分離出來，編碼的蛋白含鋅指狀多肽，在腫瘤患者骨髓和外周血中高表達，而在健康人群中僅存在微量表達或不表達[9-10]。本研究中，觀察組WT1基因表達水平高于對照組。

NKD1基因是Wnt/β-Catenin信號通路的經(jīng)典抑制物，參與調(diào)節(jié)細胞遷移、分化、增殖等生物學過程，影響造血干細胞衰老過程，且可調(diào)控骨生長和骨量生長[6]。本研究中，觀察組NKD1基因表達水平高于對照組。當機體出現(xiàn)異常時，NKD1基因表達上調(diào)，可直接激活靶基因轉(zhuǎn)錄，影響細胞衰老、增殖、生長等過程，NKD1基因表達上調(diào)可能參與了急性髓系白血病的發(fā)生、發(fā)展。對比了不同臨床特征急性髓系白血病患者WT1、NKD1基因表達情況，結(jié)果均無明顯差異。因為WT1、NKD1基因僅受啟動子區(qū)域高甲基化調(diào)控影響，而性別、年齡、FAB分型、ET0分型、核型均不是其表達水平的影響因素[11]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)WT1、NKD1基因表達水平的檢測用于急性髓系白血病診斷均有較高價值，可作為輔助診斷的分子標志物[12]，但由于本次樣本量較少，該結(jié)論還有待進一步的研究來驗證。

許晶等[13]報道，WT1基因與急性髓系白血病預后具有一定相關(guān)性。本研究中，WT1、NKD1基因表達水平均與急性髓系白血病患者生存時間呈正相關(guān)，說明WT1、NKD1基因表達水平能夠一定程度地預測治療效果。WT1基因在急性髓系白血病患者中具有較高的表達水平，主要靶基因包括細胞周期負調(diào)控基因、Wnt信號途徑基因、MAPK信號途徑基因等，參與細胞死亡、代謝、分化、生長，故在急性髓系白血病患者發(fā)生、發(fā)展、預后中具有一定作用[14]。NKD1可抑制Wnt信號通路活化，是Wnt信號通路重要的負向調(diào)節(jié)因子，當機體出現(xiàn)病變時，NKD1基因表達水平可明顯升高，與病變程度、預后相關(guān)[15]。

總而言之，WT1基因和NKD1基因表達水平呈正相關(guān)，可作為急性髓系白血病患者預后評判的重要指標，且與患者生存時間呈正相關(guān)，可作為免疫治療的靶點。