肉雞滑液囊支原體的分離鑒定和藥敏試驗

劉春凌 王鵬 利凱

摘要?通過分離培養張家口某雞場MS菌株，采用PCR方法擴增MS 16S RNA，并對分離培養菌株進行藥敏試驗。結果顯示，感染MS肉雞站立困難，跗關節和爪墊腫脹，分離培養的病原體菌落為光滑、圓形，小面積“煎蛋樣”。PCR產物在207 bp處出現條帶。藥敏試驗發現該菌落對酒石酸泰樂菌素和延胡索酸泰妙菌素敏感，最小抑菌濃度分別為0.122和0.244 μg/mL。因此，可確定該雞場已感染滑液囊支原體，推薦使用酒石酸泰樂菌素或延胡索酸泰妙菌素作為首選抑菌治療藥物。

關鍵詞?滑液囊支原體;分離;鑒定;PCR;藥敏試驗

中圖分類號?S852.62?文獻標識碼?A?文章編號?0517-6611（2021）09-0092-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.023

Abstract?Mycoplasma synoviae（MS）strains were isolated from a chicken farm in Zhangjiakou and cultured，PCR method was used to amplify?16S RNA of MS. And drug sensitivity test was made on the isolated stains. The results showed that broilers infected with MS had difficulty in standing， swelling of the tarsal joints and paw pads，?and the isolated and cultured pathogen colonies were smooth， round， with “fried egg-like” small areas. PCR product showed a band at 207 bp. The drug susceptibility test showed that the colony was sensitive to tylosin tartrate and tiamulin fumarate， and the minimum inhibitory concentrations were 0.122 and 0.244 μg/mL， respectively.?Therefore， it could be determined that the chicken farm was infected with MS， and it was recommended to use tylosin tartrate or tiamulin fumarate as the first antibacterial medicine.

Key words?Mycoplasma synoviae;Isolation;Identification;PCR;Drug sensitivity test

滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）是雞體中重要的致病性病原體之一，通過呼吸道感染進入雞只體內，會導致雞只生長發育遲緩和滑膜炎的發生，同時容易與其他疾病混合感染，加劇死亡，給雞場帶來嚴重的經濟損失[1-2]。MS同時具有水平傳播和垂直傳播的特性[3-4]。目前防治肉雞MS感染主要依靠抗生素，但隨著藥物使用時間的延長和使用范圍的擴大，其防治效果將越來越差。筆者通過分離培養張家口某雞場菌株，采用特異性PCR檢測和藥敏試驗，結合臨床癥狀和分離培養鑒別MS，并篩選出集中敏感藥物，以期為張家口地區MS病防治藥物的合理使用提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?培養基。

支原體精氨酸肉湯培養基（產品編號HB7025-5）、支原體瓊脂培養基（編號HB7025-3）、支原體肉湯培養基（產品編號HB7025-2），均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.1.2?主要試劑。

血液/細胞/組織基因組總RNA提取試劑盒（產品編號ZP311），第一鏈反轉錄試劑盒-耐高溫酶（產品編號ZR102-1），2×Ftaq PCR MasterMix（產品編號ZT201-1），DL2000 DNA Marker（產品編號ZM404-1），GoldViewTM核酸染料I（產品編號ZS209），均購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司;標準小牛血清（產品編號CS-XQ0301），購自上海莼試生物技術有限公司。

1.1.3?藥敏試驗用藥。

延胡索酸泰妙菌素（批號為獸藥字300111320，購自山東勝利生物工程有限公司），磷酸替米考星（批號為獸藥字190801599，購自河北天象生物藥業有限公司），氟苯尼考（批號為獸藥字163231120，購自華畜獸藥有限公司），鹽酸環丙沙星（批號為獸藥字150512606，購自山東魯西獸藥股份有限公司），鹽酸多西環素（批號為獸藥字163236011，購自華畜獸藥有限公司），硫酸慶大霉素（批號為獸藥原字110132337，購自華北制藥有限責任公司），鹽酸林可霉素（批號為獸藥字161016081，購自華畜獸藥有限公司），鹽酸沙拉沙星（批號為獸藥字161012630，購自華畜獸藥有限公司），酒石酸泰樂菌素（批號為獸藥字161012733，購自華畜獸藥有限公司）。

1.2?方法

1.2.1?支原體分離、鑒定培養基的制作。

嚴格按照支原體精氨酸肉湯培養基、支原體瓊脂培養基和支原體肉湯培養基產品使用說明書配制這3種培養基，高壓滅菌，冷卻，加滅活小牛血清200 mL和青霉素80萬單位，調節pH，加入無菌試管，備用。

1.2.2?病料采集與保存。

選取張家口某雞場20只疑似感染MS的肉雞，觀察其臨床癥狀。無菌收集疑似感染MS肉雞鼻孔、氣管拭子、腫脹關節液，編號標記，接種于支原體精氨酸肉湯培養基，密封保存。37 ℃下孵育36 h，觀察培養基顏色的變化。

1.2.3?菌落的分離培養。

參照顧的樂[5]的MS分離鑒定步驟，無菌抽取少量已經變黃的培養液，確定無雜菌后將可疑培養物在相同的培養基中連續傳代7～8代，然后取0.30 mL培養物接種于支原體瓊脂培養基，37 ℃厭氧環境下培養12 d，待肉眼可見菌落時挑取單菌落涂片，吉姆薩染色后，置于顯微鏡10×10倍觀察菌落形態，并用滅菌注射器針頭挑取典型單菌，接種于培養基中傳代培養。

1.2.4?PCR鑒定。

利用“1.2.3”中獲取的分離菌株，參照石曉磊等[6]的試驗方法，按照血液、細胞、組織基因組總RNA提取試劑盒說明書提取RNA，并使用第一鏈反轉錄試劑盒轉換為第一鏈cDNA作為模板，用16S rRNA基因通用引物 P1（5′-GAAGCAAAATAGTGATATCA-3′）和P2（5′-GTCGTCTCCGAAGTTAACAA-3′）對分離菌的16S rRNA進行PCR擴增。PCR反應體系為RNA模板 0.5 μL，P1和P2各 1 μL，2×Ftaq PCR MasterMix 12.5 μL，用雙蒸水補至 25 μL。PCR擴增程序如下：94 ℃預變性 3 min;94 ℃變性 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸 1 min，共32個循環;72 ℃延伸 5 min。PCR擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，預期擴增片段為207 bp。

采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測擴增產物片段。

1.2.5?藥敏試驗。

1.2.5.1?抗菌藥物的稀釋。

無菌稱取抗菌藥物溶于稀釋液中，配成濃度10 mg/mL的原液，再用液體培養基將藥液稀釋至 1 mg/mL，每種藥物取0.5 mL，于38 ℃下培養3 d后觀察，以確保無真菌或細菌污染。

1.2.5.2?常用抗菌藥物最小抑菌濃度的測定。

參照石曉磊[7]的試驗方法，對張家口地區分離鑒定的MS進行最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）測定。在滅菌EP管中分別加入支原體肉湯培養基0.4 mL，每種藥品1組，每組3個重復，每個重復15個梯度。于每組每個重復第1管加入上述抗生素溶液各0.4 mL，然后按1∶1倍比稀釋至第15管后棄去多余溶液，再分別加入40 μL待測菌液。將第16管作為陰性對照（培養基0.4 mL），第17管作為陽性對照（培養基0.4 mL+40 μL待測菌液）。將稀釋好的菌液移至96孔細胞培養板上，加蓋后置于37 ℃ CO2培養箱中觀察7 d。結果判定標準如下：第16管不變色，第17管由原來的無色變為黃色且清澈透明。觀察試驗孔的顏色變化，記錄無MS生長的最大稀釋倍數，根據藥物稀釋濃度計算菌株的最小抑菌濃度。

2?結果與分析

2.1?臨床癥狀

經觀察發現，肉雞站立困難，跗關節、腳墊腫脹，病雞俯臥不起。

2.2?菌落特征

顯微鏡觀察發現小面積、光滑、圓形、呈“煎蛋樣”的致密菌落（圖1）。

2.3?PCR鑒定

PCR擴增產物經凝膠電泳后，可見在207 bp處出現條帶（圖2）。純化菌株能擴增出特異性的雞滑液囊支原體目的片段，擴增片段與預測擴增片段相符。

2.4?藥敏試驗

藥敏試驗結果（表1）顯示，酒石酸泰樂菌素的最小抑菌濃度（MIC）最高，為0.122 μg/mL;其次為延胡索酸泰妙菌素，為0.244 μg/mL;磷酸替米考星為3.906 μg/mL;鹽酸多西環素為7.813 μg/mL;鹽酸林可霉素排在第5位，其MIC為15.625 μg/mL;氟苯尼考MIC為31.250 μg/mL，鹽酸環丙沙星和硫酸慶大霉素均為62.500 μg/mL;鹽酸沙拉沙星最不敏感，其MIC值為125.000 μg/mL。

3?討論

MS是最重要的肉雞致病性支原體之一。很多人認為MS感染是一種亞臨床呼吸道感染[8]，但越來越多報道表明MS可帶來嚴重的呼吸道感染和關節雞病，給肉雞養殖帶來嚴重的經濟損失[9-11]。

該研究從張家口某雞場疑似感染MS的肉雞鼻孔、氣管和跗關節液中成功分離培養出MS菌落，固體培養基上菌落小，圓形，光滑，有致密中央隆起，呈“煎蛋樣”。結合養殖場肉雞的臨床癥狀，鑒定為雞MS。這說明該雞場存在MS感染，結果準確可靠，可進一步開展藥敏試驗，對臨床治療能起到指導作用。

該研究采用的PCR檢測方法可快速、靈敏準確地鑒別檢測病原體，給臨床應用提供了極大的便捷和實用性[12-13]。該研究采用Lauerman等[14]的種特異性引物，通過培養、血清學方面的比較，靈敏度為82%，特異性達100%。通過PCR方法確定該雞場雞群MS感染。

在臨床治療中應對治療菌株進行藥敏試驗，以選擇有效的抗菌藥物，防止藥物浪費，節約治療成本，降低環境污染。該試驗結果表明，在延胡索酸泰妙菌素等9種抗生素中，雞MS臨床分離株對酒石酸泰勒菌素的MIC為0.122 μg/mL，延胡索酸泰妙菌素MIC為0.244 μg/mL，3株分離株MIC差異不顯著，說明酒石酸泰樂菌素與延胡索酸泰妙菌素對該菌株抑制作用明顯。鹽酸環丙沙星、硫酸慶大霉素的MIC為62.500 μg/mL，鹽酸沙拉沙星的MIC為125.000 μg/mL，抑菌效果不佳。該雞場MS敏感藥物為酒石酸泰樂菌素和延胡索酸泰妙菌素，推薦使用這2種藥物作為治療首選藥物。

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