蘋果矮化中間砧“SH6”中GID2基因的克隆及生物信息學(xué)分析

王恩瑩 晁琳珂 郝素曉 盧艷芬 姚允聰

摘要?探究GID2基因在調(diào)控植物生長發(fā)育方面的作用機(jī)制。從蘋果矮化砧木“SH6”中克隆到GID2-1和GID2-2基因，運(yùn)用MEGA7、SWISS-MODEL、DNAMAN 7.0等生物信息學(xué)工具分析其序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu);通過qRT-PCR分析GID2-1和GID2-2基因在不同激素處理下的表達(dá)情況。序列分析表明，GID2-1基因的CDS序列長度為591 bp，GID2-2為597 bp，分別編碼196、198個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì);GID2基因具有F-box結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR分析表明，在GA處理下，表達(dá)量下調(diào);相反，在PAC處理下其表達(dá)量上調(diào)。結(jié)果表明，GID2基因可能在蘋果生長發(fā)育方面發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞?SH6;GID2;生長發(fā)育;生物信息學(xué);赤霉素

中圖分類號(hào)?Q943.2?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A?文章編號(hào)?0517-6611（2021）09-0104-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.026

Abstract?In order to explore the mechanism of GID2 gene in regulating plant growth and development. The GID2-1 and GID2-2 genes from the apple dwarf rootstock “SH6”?were cloned， and?their sequence and protein structure were analyzed using bioinformatics tools such as MEGA7， SWISS-MODEL， DNAMAN7.0. The expression of GID2-1 and GID2-2 genes under different hormone treatments was analyzed by qRT-PCR. Sequence analysis showed that the CDS sequence of GID2-1 gene was 591 bp in length，GID2-2 was 597 bp，?respectively encoding a protein of 196， 198 amino acids;GID2 gene had F-box domain. qRT-PCR analysis showed that the expression level was down-regulated under GA treatment;on the contrary， its expression level was up-regulated under PAC treatment. The results indicated that GID2 gene may play an important role in apple growth and development.

Key words?SH6;GID2;Growth and development;Bioinformatics;Gibberellin

赤霉素（GA）是植物生長發(fā)育過程中不可或缺的一類重要植物激素，影響植物許多發(fā)育過程，包括種子萌發(fā)、莖伸長、花粉成熟和誘導(dǎo)開花等方面[1]。在20世紀(jì)60年代，赤霉素對(duì)植物株高的影響較大，在“綠色革命”期間，半矮化品種的發(fā)展表明了赤霉素響應(yīng)信號(hào)途徑的改變導(dǎo)致糧食產(chǎn)量的巨大增加[2]。隨著赤霉素信號(hào)途徑元件的克隆與表達(dá)分析，赤霉素信號(hào)通路的大部分成分已經(jīng)在水稻和擬南芥中鑒定出來，主要包括GA受體GID1、生長抑制蛋白DELLAs和F-box蛋白（擬南芥為SLY1，水稻為GID2）[1]，研究表明，DELLA蛋白對(duì)植物生長具有負(fù)調(diào)控作用，GA信號(hào)通過克服DELLA蛋白介導(dǎo)生長的抑制作用來促進(jìn)植株高度[3]，并提出了GA-GID1-DELLA復(fù)合物來感知GA信號(hào)從而調(diào)控植物生長的機(jī)制[4-6]。

赤霉素如何抑制DELLAs成為研究的一個(gè)熱點(diǎn)，研究表明通過對(duì)功能缺失突變體gid2-1和sly1-10的GA不敏感矮化表型的分析，發(fā)現(xiàn)水稻中GID2蛋白和擬南芥SLY1蛋白均含有F-box保守結(jié)構(gòu)域，其是GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的正調(diào)控因子[7-8]，通過催化多泛素鏈附著到DELLA蛋白上，從而使26S蛋白酶體降解DELLA蛋白，消除其對(duì)植物生長的抑制作用[9]。當(dāng)GA濃度較低時(shí)，DELLA蛋白與轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)蛋白相互作用阻礙GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，或者激活與轉(zhuǎn)錄因子（TF）相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。當(dāng)GA濃度升高后，GA與其受體蛋白GID1相結(jié)合，識(shí)別DELLA蛋白，形成GA-GID1-DELLA復(fù)合物，誘導(dǎo)DELLA蛋白GRAS結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生改變，從而使其DELLA的VHIID和LHRII基序識(shí)別F-box蛋白SLY1/GID2[10]。同時(shí)SCFSLY1-GID2復(fù)合物反過來促進(jìn)DELLA蛋白被多泛素化，然后經(jīng)26S蛋白酶體降解，從而響應(yīng)GA反應(yīng)[7-8，11-13]。

蘋果屬植物采用矮化密植方式，有利于管理[14]，結(jié)果早，果實(shí)品質(zhì)好。我國果樹生產(chǎn)中經(jīng)常采用的主要致矮方式是應(yīng)用矮化中間砧木[15-17]?！癝H6”矮化砧木是由國光蘋果與武鄉(xiāng)海棠的芽變種S19雜交得到的一種優(yōu)良蘋果半矮化中間砧木，與親本相比較，“SH6”在株高、枝皮率、尖削度、節(jié)間長度等方面具有更穩(wěn)定的抗性及矮化優(yōu)勢(shì)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，在SH6系幼樹的中間砧部位進(jìn)行培土，可以促進(jìn)樹體的營養(yǎng)生長[19]。為了詳細(xì)闡明果樹矮化調(diào)控機(jī)理，國內(nèi)外眾多研究者對(duì)果樹矮化栽培育種開展了廣泛研究，但目前對(duì)其分子機(jī)理研究尚不清晰。因此，研究在GID2基因調(diào)控下半矮化中間砧木“SH6”的生長發(fā)育，為研究GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的分子機(jī)制提供理論依據(jù)，對(duì)調(diào)控果樹生長發(fā)育過程具有極其重要的意義[20]。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

以蘋果屬植物“SH6”（Malus sp.SH6）為材料，自北京農(nóng)學(xué)院組培中心采樣，選取植物葉片進(jìn)行試驗(yàn)。冷凍于液氮中，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?蘋果屬植物GID2基因克隆。

RNA的提?。悍Q量0.1 g凍存于-80 ℃的植物葉片，采用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，北京）提取“SH6”葉片的總RNA。

合成cDNA：利用cDNA合成試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司，日本）將提取的‘SH6葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。

引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)NCBI公布的蘋果同源基因MdGId2-1（XP_028962684.1）、MdGID2-2（XP_008393765.1），利用Editseq工具設(shè)計(jì)引物，序列見表1。

基因克隆PCR反應(yīng)體系（50 μL）：cDNA模板2 μL;GID2-F（10 μmol/L）1 μL;10 μmol/L（GID2-R）1 μL;TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase（北京全式金生物公司，北京）25 μL;H2O 21 μL。

基因克隆PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物純化回收，連入pEASY-Blunt Cloning Vector載體后，轉(zhuǎn)入Trans T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物公司，北京）進(jìn)行轉(zhuǎn)化子鑒定，選取5個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2?GID2基因的生物信息學(xué)分析。

利用ProtParam網(wǎng)頁在線分析工具計(jì)算蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，如等電點(diǎn)、分子質(zhì)量等信息，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的疏水性功能;利用DNAMAN 7.0對(duì)檢索到的相關(guān)基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析;利用TMHMM工具與SignalP4.0工具分析跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽;利用NPS@的SOPMA工具對(duì)GID2-1和GID2-2二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè);利用NCBI CD-search分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域;利用SWISS-MODEL工具預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu);利用MEGA 7序列比對(duì)軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3?GID2基因在不同激素處理中的表達(dá)分析。

在“SH6”組培苗正常生長至三葉期，對(duì)其進(jìn)行不同激素處理：正常的MS培養(yǎng)基中，分別加入10 μmol/L的PAC與50 μmol/L的GA。處理后20 d取樣，用于基因表達(dá)分析。使用植物RNA提取試劑盒提取“SH6”葉片總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用CFX96TM Real Time PCR System進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。

qRT-PCR反應(yīng)體系（50 μL）：cDNA模板2 μL;qGID2-F（10 μmol/L）1 μL;qGID2-R（10 μmol/L）1 μL;2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL;H2O 6 μL。

qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min;95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 2 min;4 ℃ 保存。

取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并進(jìn)行3次獨(dú)立的試驗(yàn)。并通過使用Malus 18S核糖體RNA基因作為內(nèi)參基因的相對(duì)定量來測(cè)定轉(zhuǎn)錄水平。

1.3?數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?“SH6”植物葉片GID2基因克隆

以蘋果屬植物“SH6”葉片的cDNA為模板，克隆GID2基因，利用瓊脂糖凝膠電泳的方法，檢測(cè)得到目的條帶（圖1）。

回收純化目的條帶后，將其連接到Blunt載體上，挑選單克隆進(jìn)行菌落PCR，選擇陽性菌測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，“SH6”中GID2的CDS序列全長分別為GID2-1長591 bp，編碼196個(gè)氨基酸;GID2-2長597 bp，編碼198個(gè)氨基酸。

2.2?蘋果屬植物“SH6”GID2基因序列分析

利用ProtParam在線分析軟件對(duì)預(yù)測(cè)氨基酸序列信息發(fā)現(xiàn)GID2-1蛋白的等電點(diǎn)是7.70，分子量為21 kD，是不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，其不穩(wěn)定系數(shù)達(dá)58.35，親水性值為-0.412（預(yù)測(cè)為親水性蛋白質(zhì)）;GID2-2蛋白的等電點(diǎn)是7.67，分子量是21 kD，是不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，不穩(wěn)定系數(shù)達(dá)62.92，親水性值為-0.448（親水性蛋白質(zhì)）。利用DNAMAN7.0軟件對(duì)“SH6”GID2基因的CDS區(qū)進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，GID2-1和GID2-2同源性為87.18%（圖2）。TMHMM和SignalP4.0結(jié)果分析顯示GID2-1和GID2-2均沒有跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽（圖3）。

通過NPS@的SOPMA工具對(duì)GID2-1和GID2-2二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)GID2-1蛋白中α-螺旋比例占54.08%，延伸鏈占比3.57%，無規(guī)則卷曲占比40.31%，β-轉(zhuǎn)角最少僅占比2.04%;GID2-2蛋白中α-螺旋占比50.51%，無規(guī)則卷曲占比39.39%，延伸鏈占比6.06%，β-轉(zhuǎn)角僅占比4.04%（圖4）。

2.3?GID2蛋白保守結(jié)構(gòu)域與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

利用NCBI CD-esarch對(duì)GID2-1和GID2-2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)GID2-1和GID2-2蛋白均含有F-box保守結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)-box保守結(jié)構(gòu)域是SCF復(fù)合體的亞基，參與蛋白質(zhì)泛素化降解過程。進(jìn)一步利用SWISS-MODEL在線分析軟件對(duì)GID2-1和GID2-2進(jìn)行同源建模預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)含有F-box蛋白結(jié)構(gòu)域，其保守結(jié)構(gòu)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果一致（圖5、6）。

2.4?系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果分析

通過MEGA 7.0工具構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，比對(duì)克隆得到的GID2-1和GID2-2蛋白與NCBI中檢索到的其他物種的同源蛋白，發(fā)現(xiàn)GID2-1和GID2-2基因分別與蘋果的GID2基因聚類在同一分支上，親緣關(guān)系最近。這說明GID2蛋白可能在赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用，參與調(diào)控植物生長發(fā)育（圖7）。

2.5?GID2基因在不同激素處理中的表達(dá)分析

通過qRT-PCR檢測(cè)在MS、GA、PAC 3種不同處理下“SH6”葉片基因表達(dá)水平。結(jié)果表明，在GA處理下，GID2-1和GID2-2基因表達(dá)量顯著下降，在PAC處理下，GID2-1和GID2-2基因表達(dá)水平顯著升高。這一結(jié)果證明GID2基因確實(shí)調(diào)控GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程（圖8）。

3?討論

赤霉素（GA）作為一類調(diào)控植物株型的重要植物激素，在莖的伸長、種子萌發(fā)及果實(shí)發(fā)育等方面中扮演著重要角

色。目前已有大量研究表明，水稻、擬南芥等植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)元件，包括GA的受體蛋白GID1、負(fù)調(diào)控因子DELLA蛋白以及F-box蛋白GID2和SLY1。當(dāng)GA濃度較低時(shí)，DELLA蛋白對(duì)植物的生長發(fā)育過程產(chǎn)生抑制作用。相反，當(dāng)GA濃度升高時(shí)，GA與受體蛋白GID1相結(jié)合，與DELLA蛋白相互作用，三者之間形成了GA-GID1-DELLA復(fù)合物，被SCFSLY1/GID2復(fù)合物識(shí)別并催化，導(dǎo)致DELLA蛋白的泛素化，最終被26S蛋白酶體降解，從而下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程被激活，調(diào)節(jié)植物株高。GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)于株高相關(guān)基因的克隆分析與分子機(jī)制研究，對(duì)探究如何調(diào)控植物生長發(fā)育具有極其重要的參考意義，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐提供了理論依據(jù)。

從蘋果矮化中間砧木“SH6”葉片中分離得到CDS全長為591 bp的GID2-1和全長為 597 bp 的GID2-2基因，分別編碼196、198個(gè)氨基酸。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)GID2-1與GID2-2的CDS序列同源性高，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有F-box保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析GID2蛋白與Malus domestica中的GID2蛋白親緣關(guān)系較近，且與擬南芥的SLY1蛋白在進(jìn)化中有相同起源?！癝H6”的GID2基因在不同處理下的表達(dá)水平顯示其參與GA信號(hào)調(diào)控。因此推測(cè)其可能具有調(diào)控植物生長發(fā)育的作用。

該研究克隆和分析了“SH6”中的GID2-1和GID2-2基因，探究在不同處理下GID2-1和GID2-2基因表達(dá)的影響，有助于深入研究GID2蛋白在調(diào)控蘋果株高的分子機(jī)制，為“SH6”作為蘋果矮化中間砧木的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] ACHARD P，GENSCHIK P.Releasing the brakes of plant growth：How GAs shutdown DELLA proteins[J].Journal of experimental botany，2009，60（4）：1085-1092.

[2] DAVIRE J M，ACHARD P.Gibberellin signaling in plants[J].Development，2013，140（6）：1147-1151.

[3] HARBERD N P.Relieving DELLA restraint[J].Science，2003，299（5614）：1853-1854.

[4] GRIFFITHS J，MURASE K，RIEU I，et al.Genetic characterization and functional analysis of the GID1 gibberellin receptors in Arabidopsis[J].The plant cell，2006，18（12）：3399-3414.

[5] UEGUCHI-TANAKA M，NAKAJIMA M，KATOH E，et al.Molecular interactions of a soluble gibberellin receptor，GID1，with a rice DELLA protein，SLR1，and gibberellin[J].The plant cell，2007，19（7）：2140-2155.

[6] WILLIGE B C，GHOSH S，NILL C，et al.The DELLA domain of GA INSENSITIVE mediates the interaction with the GA INSENSITIVE DWARF1A gibberellin receptor of Arabidopsis[J].The plant cell，2007，19（4）：1209-1220.

[7] SASAKI A，ITOH H，GOMI K，et al.Accumulation of phosphorylated repressor for gibberellin signaling in an F-box mutant[J].Science，2003，299（5614）：1896-1898.

[8] MCGINNIS K M，THOMAS S G，SOULE J D，et al.The Arabidopsis SLEEPY1 gene encodes a putative F-box subunit of an SCF E3 ubiquitin ligase[J].The plant cell，2003，15（5）：1120-1130.

[9] LECHNER E，ACHARD P，VANSIRI A，et al.F-box proteins everywhere[J].Current opinion in plant biology，2006，9（6）：631-638.

[10] HIRANO K，ASANO K，TSUJI H，et al.Characterization of the molecular mechanism underlying gibberellin perception complex formation in rice[J].The plant cell，2010，22（8）：2680-2696.

[11] DAVIRE J M，ACHARD P.A pivotal role of DELLAs in regulating multiple hormone signals[J].Molecular plant，2016，9（1）：10-20.

[12] DILL A，THOMAS S G，HU J H，et al.The Arabidopsis F-box protein SLEEPY1 targets gibberellin signaling repressors for gibberellin-induced degradation[J].The plant cell，2004，16（6）：1392-1405.

[13] FU X D，RICHARDS D E，F(xiàn)LECK B，et al The Arabidopsis mutant sleepy1gar2-1 protein promotes plant growth by increasing the affinity of the SCFSLY1 E3 ubiquitin ligase for DELLA protein substrates[J].The plant cell，2004，16（6）：1406-1418.

[14] 李正之.果樹矮化密植[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1982.

[15] 馬寶焜，徐繼忠，孫建設(shè).關(guān)于我國蘋果矮砧密植栽培的思考[J].果樹學(xué)報(bào)，2010，27（1）：105-109.

[16] 李丙智，韓明玉，張林森，等.我國矮砧蘋果生產(chǎn)現(xiàn)狀與發(fā)展緩慢的原因分析及建議[J].煙臺(tái)果樹，2010（2）：1-4.

[17] 顧文毅，劉小利.矮化砧木在青海地產(chǎn)軟兒梨樹上的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（21）：8932-8933，8935.

[18] 郝素曉.赤霉素介導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白調(diào)控蘋果砧木矮化特性研究[D].重慶：西南大學(xué)，2019.

[19] 李洪娜，彭玲，姜翰，等.中間砧不同埋土深度對(duì)蘋果幼樹葉片保護(hù)酶活性和植株生長的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46（4）：39-42.

[20] 魏靈珠，程建徽，李琳，等.赤霉素生物合成與信號(hào)傳遞對(duì)植物株高的調(diào)控[J].生物工程學(xué)報(bào)，2012，28（2）：144-153.