電離輻射對胃腸道間質瘤細胞增殖以及Ano1蛋白表達的影響

陳詣佳，胡笑宇，劉 希，楊文生，康政宇，何升東，張 林

胃腸道間質瘤（gastrointestinal stromal tumor,GIST）是胃腸道最常見的間質腫瘤，其表達的Ano1與GIST的生長增殖密切相關，可通過抑制胰島素樣生長因子結合蛋白5的表達，從而促進GIST生長增殖，同時也是GIST表達的一個敏感特異性標記物[1-2]。以往觀念認為，GIST屬于軟組織肉瘤，對放射治療不敏感[3]，但其實在某些情況下放療已被納入GIST的多學科治療策略。放療作為手術的輔助手段，可能會抑制GIST對伊馬替尼耐藥性的發(fā)生，而且術前放療有助于減少切除范圍保留更多正常組織和更安全的劑量遞增[4-5]。此外，在局部進行性或轉移性GIST中，與放療造成的毒性損傷相比，進行短期放射治療對減輕具的局部癥狀更為有效[6-7]。最近十幾年來，國外已有不少放療在胃腸道間質瘤治療中取得了明顯效果的報道，但是目前尚未見對GIST放療機制的基礎研究報道。因此，本研究擬通過研究GSIT對電離輻射的敏感性，從而臨床上GIST的放療提供科學依據(jù)，為GIST放療機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞來源和培養(yǎng) 實驗細胞為人胃腸道間質瘤細胞GIST-T1，由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院提供。細胞培養(yǎng)基為CM5-1，成分為89%McCoy’s 5A培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗。細胞于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁生長，上皮細胞樣，梭形，成塊生長。

1.1.2 主要試劑及儀器 醫(yī)用電子直線加速器（美國VARIAN公司），McCoy’s 5A培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），胎牛血清（美國Sciencell公司），兔源Anti-TMEM16A多克隆一抗、山羊抗兔IgG H&L（HRP）二抗（英國Abcam公司），PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司），蛋白預染marker、GAPDH抗體（Thermo Fisher公司），Total RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司），CCK-8試劑盒（碧云天生物技術有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱、高速低溫冷凍離心機、超聲波細胞破碎儀（美國ThermoFisher公司），超凈工作臺（蘇州華新空調凈化有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 GIST細胞分組與電離輻射 參考RYOO S B等[8]和鐘軍等[9]的文獻，電離輻射采用醫(yī)用直線加速器，輻射線源為1.25 MeV的γ射線，照射總劑量分別為2 Gy、5 Gy、7 Gy。照射劑量率為1.0 Gy/min。實驗時間點分別為照射后1天，2天，3天，4天，5天。

1.2.2 細胞增殖 取對數(shù)生長期的GIST-T1細胞，PBS洗滌，胰蛋白酶消化后收集，250 g離心5 min，吸除上清液，制備單細胞懸液，調節(jié)細胞密度3×104個/mL，100μL/孔接種于96孔板中，待細胞貼壁后，設置0 Gy、2 Gy、5 Gy、7 Gy組，每組6重復，按實驗方案進行電離輻射，同一塊板為相同輻射劑量。電離輻射后放入孵箱，培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后，吸棄上清，無血清培養(yǎng)基1:10稀釋CCK8試劑，避光加入已稀釋CCK8工作液110μL/孔，并輕輕晃動培養(yǎng)板數(shù)次，37℃、5%CO2恒溫繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。將孔板中的待檢測液體每孔吸取90μL移入干凈的96孔板中，使用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光值。

1.2.3 細胞凋亡 取對數(shù)生長期的GIST-T1細胞，PBS洗滌，胰蛋白酶消化收集，250 g離心5 min，吸除上清液，制備單細胞懸液。調節(jié)細胞密度5×104個/孔，500μL/孔接種于24孔板中。待細胞貼壁后，設置未照射、2 Gy、5 Gy、7 Gy組，每組3重復，同板為相同輻射劑量。電離輻射后細胞分別培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后，收集上清，用PBS洗滌細胞2次，用不含EDTA胰酶消化，收集細胞與備用上清混勻，將細胞液移入1.5 mL管中。350 g離心5 min，吸除上清液，PBS洗滌1次，棄上清。用500μL的Binding Buffer重懸細胞，加入5μL AnnexinV APC混勻后，加入5μL的PI混勻。室溫避光，反應10 min，進行流式細胞儀檢測。

1.2.4 蛋白質印記 按說明書提取細胞總蛋白，NanoDrop2000核酸蛋白儀測定蛋白濃度。使用10%SDS-PAGE凝膠電泳，260 A，120 min轉入PVDF膜中，脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜10 min×3遍，分別加入TMEM16A抗體、GAPDH抗體（1:1000），4℃搖床過夜。TBST洗膜10 min×3遍，二抗（1:50000）室溫孵育90 min，TBST洗膜10 min×3遍。ECL發(fā)光液覆蓋，顯影曝光處理。

1.2.5 RT-PCR 按照RNAiso Plus試劑盒的說明，用RNAiso Plus從新鮮培養(yǎng)細胞中提取總RNA。通過NanoDrop2000測定RNA濃度和純度，使用逆轉錄試劑盒Prime Script RT Master Mix轉錄RNA為cDNA。根據(jù)Prime Script RT Master Mix試劑盒說明書，進行RT-PCR反應，反應條件為95℃，30 s和60℃，45秒，共40個循環(huán)，GAPDH為內參。引物由擎科生物有限公司設計合成，引物序列如下：Ano1上游引物：5’-CATCACACCAAGCCGACCTC-3’；Ano1下游引物：5’-CCCTGGAAGCCCTAAGACT-3’；GAPDH上游引物：5’‐CAATGACCCCTTCATTGACC-3’；GAPDH下游引物：5’‐GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)用Excel軟件處理，SPSS20.0軟件分析，結果以（±s）表示。組間計量資料對比作方差齊性和正態(tài)性檢驗，滿足方差齊性，以one-wayANOVA法進行方差分析，不滿足方差齊性，則以非參數(shù)法檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 細胞生長狀態(tài)觀察 胃腸道間質瘤細胞在CM5-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如圖1，倒置顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)10×10，細胞貼壁生長，上皮細胞樣，梭形，成塊生長。見圖1。

GIST細胞接受電離輻射后第1天，如圖2，倒置顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)10×10，視野內細胞數(shù)量，照射組與未照射組相比差別不大，照射后第1天電離輻射對細胞增殖的抑制效應不明顯。

圖2 電離輻射后1天細胞生長形態(tài)

GIST細胞接受電離輻射后第2天，如圖3，倒置顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)10×10，視野內細胞數(shù)量，2 Gy照射組與未照射組相比差異不大，而5 Gy、7 Gy照射組與未照射組相比可發(fā)現(xiàn)細胞數(shù)量略少。

圖3 電離輻射后2天細胞生長形態(tài)

GIST細胞接受電離輻射后第3天，如圖4，倒置顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)10×10，視野內細胞數(shù)量，2 Gy照射組不如未照射組密集，5 Gy照射組少于未照射組，7 Gy照射組更少，可見微量細胞漂浮于培養(yǎng)基上，可能是凋亡細胞。

圖4 電離輻射后3天細胞生長形態(tài)

GIST細胞電離輻射后第4天，如圖5，倒置顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)10×10，視野內細胞數(shù)量，2 Gy照射組不如未照射組密集，5 Gy照射組明顯少于未照射組，可見微量漂浮細胞，7 Gy照射組細胞數(shù)量更少，可見少量漂浮細胞，可能是凋亡細胞。

圖5 電離輻射后4天細胞生長形態(tài)

GIST細胞接受電離輻射后第5天，如圖6，倒置顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)10×10，視野內細胞數(shù)量，未照射組極度密集，多于2 Gy照射組，2 Gy照射組可見微量漂浮細胞，5 Gy照射組細胞數(shù)量遠不如未照射組，可見少量漂浮細胞，7 Gy照射組細胞數(shù)量更少，可見多量漂浮細胞，可能是凋亡細胞。

圖1胃腸道間質瘤細胞生長形態(tài)

圖6 電離輻射后5天細胞生長形態(tài)

2.2 細胞增殖活性檢測結果 GIST細胞在接受電離輻射后，其增殖受到抑制。相同照射劑量下，隨著照射后時間延長，抑制增殖的作用越來越明顯；相同時間點下，提高照射劑量能增加電離輻射對GIST細胞增殖的抑制作用。通過公式抑制率=（1-實驗組OD/對照組OD）×100%，計算不同電離輻射劑量處理后細胞的抑制率。見表1。

表1 不同電離輻射劑量處理細胞后的抑制率（%）

2.3 細胞凋亡檢測結果 細胞凋亡實驗表明，胃腸道間質瘤細胞在接受電離輻射后，出現(xiàn)細胞凋亡的現(xiàn)象。在相同照射劑量下，隨著照射后時間延長，細胞凋亡率逐漸升高；在相同時間點下，照射劑量越大，細胞凋亡率越高。見表2。

表2 電離輻射對細胞的凋亡影響（±s）

表2 電離輻射對細胞的凋亡影響（±s）

注：與同時間點0 Gy組相比，*為P＜0.05，**為P＜0.01

組 別0 Gy組2 Gy組5 Gy組7 Gy組5 d 8.27±0.86 18.57±1.04**25.79±2.56*31.92±0.74**1 d 4.34±0.85 6.53±1.25 5.59±0.80 6.20±2.23 2 d 5.75±1.91 6.72±2.20 11.08±1.43**12.76±1.76**3 d 8.99±1.76 19.63±1.56**18.09±2.26**21.24±1.14**4 d 7.52±0.80 12.40±0.74**22.63±2.06**24.87±1.60**

2.4 RT-PCR結果 電離輻射后，胃腸道間質瘤細胞的Ano1表達隨時間呈現(xiàn)先下降然后逐漸回升的趨勢。隨著照射總劑量增加，對Ano1的表達抑制越來越明顯。照射劑量越大，Ano1的表達抑制作用越早達到最大值，同時Ano1的表達恢復越來越慢。見表3、圖7。

表3 電離輻射對胃腸道間質瘤Ano1、mRNA的表達影響

圖7 電離輻射后Ano1的mRNA表達（a、b、c）

2.5 蛋白免疫印記結果 如圖8，Ano1蛋白是一條114 KD的條帶，符合Ano1蛋白分子量的大小。胃腸道間質瘤細胞接受照射后Ano1的蛋白表達變化趨勢基本能符合照射后Ano1的mRNA表達變化趨勢。隨著照射劑量增大，Ano1表達下降幅度越來越大，下降的速度越來越快，恢復越來越慢。見表4、圖8。

表4 電離輻射對胃腸道間質瘤Ano1蛋白的表達影響

圖8 Ano1蛋白表達量

3 討論

放射治療是治療腫瘤的重要手段之一。影響療效的因素是多方面的，如腫瘤的位置，腫瘤的大小、乏氧細胞的數(shù)量、腫瘤細胞的放射敏感性、治療計劃的合理性等。其中腫瘤細胞的放射敏感性是最重要的內在因素[10]。影響腫瘤細胞對放射治療敏感性的因素有很多，其中腫瘤細胞的增殖活性與腫瘤細胞的放療敏感性密切相關[11]。因此，我們采用CCK8實驗，檢測不同劑量照射后，各個時間段GIST細胞的增殖活性。本研究表明，電離輻射對GIST細胞的活性影響具有劑量和時間效應。GIST細胞在接受電離輻射后，其增殖受到抑制。在同一時間點，照射劑量越大，抑制細胞增殖的作用越大。在同一劑量照射，隨著照射后時間延長，電離輻射對細胞的增殖抑制作用越來越明顯。因此，電離輻射對GIST細胞的抑制作用具有劑量依賴性和時間依賴性，需要一定的劑量并且通過一定的時間積累才能達到抑制腫瘤增殖的效果。所以我們下一步實驗可通過增加不同劑量照射組，適當延長照射后的時間，計算抑制作用達到峰值時的天數(shù)，進而尋找適合的照射劑量和照射周期，為未來臨床上GIST放療方案的制定提供參考。

細胞凋亡率是衡量腫瘤細胞放射敏感性的另一項重要指標。本實驗表明，電離輻射可以誘導GIST細胞發(fā)生凋亡。相同照射劑量，隨著照射后時間延長，細胞凋亡率逐漸升高；相同時間點，照射劑量越大，細胞凋亡率越大。證明了放射誘導的GIST細胞凋亡具有時間和劑量的依賴性。

我們的研究表明，GIST細胞在接受電離輻射后，在mRNA水平上，Ano1的表達呈現(xiàn)出先降低，隨著時間緩慢恢復的趨勢，且隨著照射劑量增加，Ano1表達下降的程度越大、下降速度越快而且Ano1的表達恢復速度越慢。在蛋白質水平上與mRNA趨勢一致。已有研究表明，Ano1與GIST細胞的生長發(fā)育密切相關，有著調節(jié)促進GIST細胞生長的功能[2]。除了GIST外，在胃癌中，Ano1的轉錄激活可以促進胃癌的進展，Ano1在胃癌組織中過表達，并且與胃癌腫瘤-淋巴結轉移階段相關。在體外實驗中，敲低Ano1顯著抑制了胃癌細胞的遷移和侵襲，而Ano1的缺失導致體內腫瘤轉移受到抑制[12]。而在MCF7和MDA-MB-231乳腺癌細胞中，用T16Ainh-A01或siRNA抑制Ano1可以顯著抑制細胞增殖。siRNA敲低Ano1誘導G0/G1細胞周期停滯，并顯著抑制乳腺癌細胞的侵襲性[13]。因此，Ano1在各種不同類型的腫瘤中，無論是在調控腫瘤增殖方面還是在控制腫瘤轉移侵襲等方面都起著不可或缺的作用，我們研究電離輻射對GIST細胞Ano1的表達變化，除了為GIST的放療機制奠定基礎，還能為其他類型腫瘤放療機制的研究提供新的思路。綜上所述，電離輻射對GIST細胞具有抑制細胞增殖和促進凋亡的作用，這也提示GIST細胞對電離輻射有一定敏感性，這為未來制定GIST的放療方案提供了參考，為放療在GIST治療中的應用提供了科學依據(jù)，更是為進一步研究GIST放療機制奠定了基礎。本研究表明，GIST細胞接受照射后，Ano1的表達出現(xiàn)先降低、后回升的變化趨勢，為以后深入研究GIST的放療機制，進一步繼續(xù)以Ano1為靶點研究GIST放療敏感機制奠定了研究基礎。