帕金森病病人血清miR-543-3p、miR-124表達與IGF-1、BDNF、NGF水平的相關性

趙 利，李海燕，王書霞

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是臨床常見的一種神經系統(tǒng)退變性疾病，調查顯示PD病人伴有輕度認知功能障礙，神經元損傷可造成認知功能損害，隨著疾病進展可發(fā)展為帕金森病癡呆[1-3]。因此，探尋PD發(fā)生及發(fā)展相關的基因或蛋白有助于減緩疾病進展。有研究表明，微小RNA-543-3p(microRNA-543-3p，miR-543-3p)在PD小鼠模型中表達上調，但關于其作用機制尚未闡明[4]。相關報道指出，微小RNA-124(microRNA-124，miR-124)在PD病人中呈低表達，并可能作為PD治療的潛在生物標志物[5]。有研究表明，胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor-1，IGF-1)、腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、神經生長因子(nerve growth factor，NGF)水平降低與認知功能障礙密切相關[6]。本研究以PD病人為觀察對象，檢測血清miR-543-3p、miR-124的表達水平，探究其與PD發(fā)生、發(fā)展及IGF-1、BDNF、NGF水平的相關性，為揭示PD發(fā)生發(fā)展的分子機制奠定理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年5月—2018年5月本院收治的PD病人80例為PD組，所有病人均符合PD診斷標準[7]。其中，男46例，女34例，年齡(63.54±9.58)歲。收集同期本院體檢中心的健康志愿者50名為對照組，其中男27名，女23名，年齡(64.32±8.95)歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：臨床資料完整；未合并高血壓、糖尿病等疾病者。排除標準：心、肺、腎等臟器嚴重損傷；合并全身感染性疾病；阿爾茨海默病；血管性癡呆；心、肺等導致的認知功能障礙；焦慮、抑郁等心理疾病；意識障礙。根據Hoehn-Yahr分級標準[8]對PD病人進行評分，將病人分為1期16例，2期24例，3期13例，4期15例，5期12例。帕金森評定量表(UPDRS)評分標準：0～<50分為輕度；50～<100分為中度；100～199分為重度[9]，根據UPDRS評分標準將PD病人分為輕度27例、中度31例、重度22例。根據蒙特利爾認知評估量表(Montreal Cognitive Assessment，MoCA)將PD病人分為輕度認知功能障礙(PD-MCI)33例，無認知功能障礙(PD-NCI)47例。MoCA評分≥26分為認知功能正常，MoCA評分<26分為認知功能障礙[10]。本研究經本院倫理委員會批準，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 采集血液樣本 所有研究對象均采集清晨空腹靜脈血5 mL，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取血清放入EP管內，置于-80 ℃超低溫冰箱內保存。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測miR-543-3p、miR-124的表達水平 根據Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書提取血清中的總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度，RNA OD260/OD280為1.8～2.0。參照反轉錄試劑盒說明書(北京天根生化科技有限公司生產)將總RNA合成cDNA，miR-543-3p正向引物5′-ATTCGCGGTGCACTTCTTTT-3′，反向引物5′-GCATCGACT AGCTGGCATC-3′；miR-124正向引物5′-CCTGGTATCCACTGTAGGCC-3′，反向引物5′-TCAGCTCAGCATCGACTAGG-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCA CATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。以cDNA進行qRT-PCR反應(北京天根生化科技有限公司)，擴增反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水(ddH2O)補足體系至20 μL；反應條件：95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40次循環(huán)。miR-543-3p、miR-124以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-543-3p、miR-124相對表達量。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清IGF-1、BDNF、NGF水平 采用ELISA法檢測血清IGF-1、BDNF、NGF水平，檢測試劑盒購自南京建成生物研究所，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

2 結 果

2.1 PD組與對照組血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較 與對照組比較，PD組血清miR-543-3p表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-124表達水平明顯降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 PD組與對照組血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較(±s)

2.2 不同Hoehn-Yahr分期PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較 與1期、2期比較，3期、4期、5期PD病人血清miR-543-3p的表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達水平明顯降低(P<0.05)；與3期比較，4期、5期PD病人血清miR-543-3p的表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達水平明顯降低(P<0.05)；與4期比較，5期PD病人血清miR-543-3p的表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達水平明顯降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 不同Hoehn-Yahr分期PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較(±s)

2.3 不同UPDRS評分組PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較 與輕度組比較，中度組、重度組血清miR-543-3p的表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達水平明顯降低(P<0.05)；與中度組比較，重度組血清miR-543-3p的表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達水平明顯降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 不同UPDRS評分組PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較(±s)

2.4 PD組與對照組血清IGF-1、BDNF、NGF水平比較 與對照組比較，PD組血清IGF-1、BDNF、NGF水平明顯降低(P<0.05)。詳見表4。

表4 PD組與對照組血清IGF-1、BDNF、NGF水平比較(±s) 單位：ng/mL

2.5 PD病人血清miR-543-3p、miR-124與IGF-1、BDNF、NGF水平的相關性分析 采用Pearson法分析PD病人血清miR-543-3p、miR-124與IGF-1、BDNF、NGF水平的相關性，結果顯示，miR-543-3p與IGF-1、BDNF、NGF呈負相關(P<0.05)，miR-124與IGF-1、BDNF、NGF呈正相關(P<0.05)。詳見表5。

表5 PD病人血清miR-543-3p、miR-124與IGF-1、BDNF、NGF水平的相關性

2.6 PD-MCI組與PD-NCI組血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較 與PD-NCI組比較，PD-MCI組血清miR-543-3p的表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-124的表達水平明顯降低(P<0.05)。詳見表6。

表6 PD-MCI組與PD-NCI組血清miR-543-3p、miR-124表達水平比較(±s)

3 討 論

miRNA可通過調控下游靶基因表達從而參與神經系統(tǒng)性疾病等多種疾病發(fā)生及發(fā)展過程，研究表明miR-543-3p表達上調可促進炎癥性疾病及膀胱癌等多種疾病發(fā)生及發(fā)展[11-13]。本研究結果顯示，PD病人血清miR-543-3p的表達水平明顯升高，隨著Hoehn-Yahr分級、UPDRS評分的增高，血清miR-543-3p的表達水平明顯升高，提示miR-543-3p表達上調可能促進PD發(fā)生及發(fā)展，并可能在PD發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調控作用。miR-124表達上調可促進PD小鼠神經元細胞增殖[14]。miR-124在PD小鼠模型中表達下調，并可在炎癥反應中發(fā)揮重要調控作用[15-16]。本研究結果顯示，PD病人血清miR-124的表達水平明顯降低，隨著Hoehn-Yahr分級、UPDRS評分的增高，血清miR-124的表達水平明顯降低，提示miR-124表達量降低與PD疾病進展密切相關，并可在PD發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要調控作用。血清學生物標記物廣泛應用于認知水平評估，IGF-1屬于多功能細胞增殖調控因子，并可促進細胞增殖、分化等，中樞神經系統(tǒng)的膠質細胞與神經元可分泌IGF-1，若病人腦組織損傷發(fā)生時IGF-1水平降低。BDNF屬于神經營養(yǎng)因子家族成員并可保護神經元存活及生長，腦組織中BDNF表達水平升高可反映神經細胞修復能力增強。NGF屬于神經營養(yǎng)因子并可促進神經元生長發(fā)育，其表達量減少預示腦神經系統(tǒng)的損傷[17-18]。本研究結果顯示，PD病人血清IGF-1、BDNF、NGF水平明顯降低，與上述研究結果相似，提示PD病人伴有認知功能損傷。本研究采用Pearson法檢測PD病人血清miR-543-3p、miR-124表達與IGF-1、BDNF、NGF的相關性，結果顯示，miR-543-3p與IGF-1、BDNF、NGF呈負相關，miR-124與IGF-1、BDNF、NGF呈正相關，說明隨著miR-543-3p表達量升高與miR-124表達量降低PD病人認知水平明顯降低，提示miR-543-3p、miR-124表達異常可能與PD病人認知功能密切相關。研究表明，PD病人認知損害發(fā)生率較高且已威脅人類生命安全[19]。本研究結果顯示，PD-MCI組血清miR-543-3p的表達水平明顯高于PD-NCI組，血清miR-124的表達水平明顯低于PD-NCI組，說明PD認知功能障礙病人miR-543-3p表達上調、miR-124表達下調。提示miR-543-3p、miR-124可能成為診斷PD病人認知功能障礙的重要指標。

綜上所述，PD病人血清miR-543-3p的表達水平明顯升高，miR-124的表達水平明顯降低，并可參與PD發(fā)生及發(fā)展過程，其表達量與IGF-1、BDNF、NGF水平密切相關，可作為判斷PD疾病進展及評估病人認知水平的重要輔助指標。