多重耐藥鮑曼不動桿菌相關耐藥基因的研究

姜梅杰,朱 剛,王 薇,陳 霞,趙書平*

(1.泰安市中心醫院 檢驗科，山東 泰安271000；2.泰安市泰山區人民醫院 外科，山東 泰安271000；3.泰安市中心醫院 ICU，山東 泰安271000；4.泰安市中心醫院 急診科,山東 泰安271000)

近年來多重耐藥鮑曼不動桿菌的迅速增加，已給院內耐藥菌感染控制及治療帶來巨大的挑戰。醫院多重耐藥菌分析發現，多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDRAB)分離數位居第1位，與有關報道一致[1]。由于鮑曼不動桿菌適應性較強，定植率高，給院內感染控制帶來極大挑戰。為了治療和控制MDRAB在院內的感染和傳播，了解MDRAB耐藥機制，對泰安市中心醫院2019年2月至2019年10月間院內分離的15株MDRAB進行研究，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源篩選出的15株MDRAB，來自2019年2月至2019年10月該院各臨床科室檢測到的非重復標本。12株來源于痰標本、1株血液標本、1株胸腔穿刺液標本、1株尿液標本。其中ICU重癥監護病房7株、呼吸重癥監護病房3株、神經內科重癥監護病房2株、神經外科重癥監護病房1株、腎內科病房1株、急診科普通病房1株。

1.2 細菌鑒定及藥物敏感性試驗嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》(4版)進行細菌鑒定的操作。采用西門子WalkAway 96 PLUS NUC61復合板進行菌種鑒定及藥物敏感性試驗，K-B法檢測頭孢吡肟、厄他培南及頭孢哌酮/舒巴坦藥物敏感性。藥物敏感性試驗判讀嚴格執行最新版CLSI標準，其中頭孢哌酮/舒巴坦藥物敏感性試驗執行CLSI中頭孢哌酮的標準，替加環素藥物敏感性試驗執行FDA的標準。K-B法藥敏紙片及M-H瓊脂均為英國Oxoid產品。銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922作為質控菌株。

1.3 多位點序列分型(MLST)用PCR對鮑曼不動7個管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD進行序列擴增并測序。根據MLST數據庫確定等位基因型及ST型(http://pubmlst.org/abaumannii)。再用eBURST(version 3;http://eburst.net)進行菌株親緣性分析，將STs歸類為克隆復合體(CC)，其中7個位點中有6個及6個以上位點相同定義為遺傳相關克隆[2-3]。

1.4 耐藥基因檢測采用煮沸法提取細菌DNA模板，多聚酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法，對β-內酰胺類耐藥基因、喹諾酮類耐藥基因、消毒劑耐藥基因qacE△及氨基糖苷類等相關耐藥基因進行檢測，引物參照文獻[4-7]。NDM基因擴增引物序列參照中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所公布引物序列。

1.5 DNA測序部分陽性基因PCR產物由青島睿博興科生物技術有限公司進行測序，并將測序結果在GenBank網上查詢。

2 結果

2.1 抗菌藥物敏感試驗結果15株MDRAB對頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢曲松、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、環丙沙星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南均100%耐藥，14株對阿米卡星和妥布霉素耐藥，1株對阿米卡星和妥布霉素敏感；14株對替加環素敏感，1株中介。11株對頭孢哌酮/舒巴坦耐藥,4株對頭孢哌酮/舒巴坦中介；9株對左氧氟沙星耐藥，5株對左氧氟沙星敏感、1株對左氧氟沙星中介。

2.2 MLST分子分型結果15株MDRAB的MLST分子分型，共有5個序列類型，其中7株(46.7%)ST195型、3株(20%)ST369型、2株(13.3%)ST208型、2株(13.3%)ST368型、1株(6.7%)ST540型。均屬于克隆復合體CC92[8]。

2.3 β-內酰胺類耐藥基因及測序結果15株MDRAB100%攜帶blaOXA23基因(見圖1)、blaOXA-51基因(見圖2)及blaOXA64gp基因(見圖3)，9株(60%)TEM基因PCR擴增陽性(見圖4)，未檢測出B類β內酰胺酶基因。隨機取不同ST的blaOXA51、blaOXA-23、blaOXA64gp和TEM陽性基因PCR擴增產物進行測序，結果分別為blaOXA-51、blaOXA-23、blaOXA-66(見圖5)型碳青霉烯酶基因和TEM-1廣譜β-內酰胺酶。

圖1 OXA23基因PCR擴增結果

圖2 OXA51基因PCR產物擴增結果

圖3 OXA64基因PCR產物擴增結果

圖4 TEM-1基因PCR產物擴增結果

圖5 OXA66基因PCR產物測序圖

2.4 喹諾酮類、氨基糖苷類及消毒劑qacE△1耐藥基因及測序結果15株MDRAB中，15株(100%)ant(3″)-Ⅰ基因陽性(見圖6)，13株(86.7%)armA基因陽性(見圖7)，4株(26.7%)aac(3)-Ⅰ基因陽性(見圖8)，6株(40%)aac(6′)-Ⅰ基因陽性(見圖9)，15株100%攜帶qacE△1基因(見圖10)。未檢出質粒介導喹諾酮類耐藥基因。隨機抽取ant(3″)-Ⅰ、aac(3)-Ⅰ、aac(6′)-Ⅰ及armA陽性基因PCR擴增產物進行測序，結果分別為16SrRNA甲基化酶基因armA、氨基糖甙類修飾酶基因ant(3″)-Ⅰ、aac(3)-Ⅰ和aac(6′)-Ⅰ。

圖6 ant(3″)-Ⅰ基因PCR擴增結果

圖7 armA基因PCR擴增結果

圖8 aac(3)-Ⅰ基因PCR擴增結果

圖9 aac(6′)-Ⅰ基因PCR擴增結果

圖10 qacE△1基因PCR擴增結果

3 討論

MDRAB是院內感染的重要病原菌之一。2019年本院臨床分離非重復鮑曼不動桿菌581株，碳青霉烯藥物亞胺培南耐藥率大于58%，本院院內分離的鮑曼不動桿菌自2012年以來，對亞胺培南耐藥率一直很高，但低于有關報道[9]。本研究15例MDRAB菌株，12株(80%)分離于痰標本，13株(86.7%)分布于各重癥監護病房，說明本院MDRAB主要來源于各重癥監護病房、使用機械通氣患者的上呼吸道標本痰液，主要引起呼吸道感染。這與有關報道一致[10]。鮑曼不動桿菌環境適應性很強，易定植在呼吸機的管道上，可在吸痰時被沖入痰液，因此培養陽性后需根據癥狀、實驗學和影像學等結果排除定植以明確感染。有研究顯示重癥監護室中鮑曼不動桿菌的感染暴發與其環境傳播密切相關[11]。

運用多位點基因測序MLST法對15株MDRAB進行親緣性分析，結果有5個序列類型，其中7株(46.7%)ST195型、3株(20%)ST369型、2株(13.3%)ST208型、2株(13.3%)ST368型、1株(6.7%)ST540型，均屬于克隆復合體CC92[8]，且發現在不同時間段ICU重癥病房和其它科室重癥病房都出現過ST195型和ST369型MDRAB流行株，說明ST195型和ST369型MDRAB一定時段內在院內存在播散流行，這可能和病人的轉入轉出有關。提示醫院感控部門應加強重癥監護病房轉入轉出多重耐藥菌患者的管理，預防院內感染爆發。

15株MDRAB氨基糖苷類修飾酶ant(3″)-Ⅰ、aac(6′)-Ⅰ和aac(3)-Ⅰ的攜帶率分別為100%(15/15)、40%(6/15)和26.7%(4/15)，未檢出其他氨基糖苷類修飾酶；16S rRNA甲基化酶基因armA的攜帶率為86.7%(13/15)。對慶大霉素100%耐藥，其中13株攜帶16S rRNA甲基化酶基因armA的MDRAB對阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素100%耐藥。本院鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥與氨基糖苷類耐藥基因密切相關。對環丙沙星100%耐藥，9株對左氧氟沙星耐藥，耐藥率為60%，但未檢出質粒介導的喹諾酮類耐藥基因，說明本院MDRAB對喹諾酮類耐藥與質粒介導的喹諾酮類耐藥基因無關，需要進一步加強對其它耐藥機制的監測和研究。左氧氟沙星耐藥率為60%，和其它臨床常用藥物相比耐藥率相對偏低，可作為MDRAB耐藥菌感染治療的聯合用藥。15株MDRAB 100%攜帶消毒劑耐藥基因qacE△1。對消毒劑的高耐藥率也可能是MDRAB在本院內流行的重要原因之一。

15株MDRAB中均攜帶blaOXA-51、blaOXA23、blaOXA64gp基因，9株(60%)攜帶TEM-1基因。對β-內酰胺及加酶抑制劑藥物頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢曲松、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林/舒巴坦、亞胺培南、美羅培南均表現出100%的高耐藥率，未出現對替加環素耐藥菌株。TEM為超廣譜β-內酰胺酶(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)，主要水解氧亞胺基頭孢菌素以及氨曲南等單環β-內酰胺類抗生素[12]，可被β-內酰胺酶抑制劑所抑制。Krizova等[13]發現TEM-1型酶基因表達水平與舒巴坦最小抑菌濃度(minimuminhibitory concentration,MIC)成正相關。鮑曼不動桿菌對碳青霉稀類抗生素的耐藥機制主要為產生碳青霉烯酶，blaOXA-51為鮑曼不動桿菌染色體上固有基因，其它均為獲得性碳青霉稀酶基因[14]。本研究顯示，除固有基因blaOXA-51檢出率為100%外，blaOXA-23和blaOXA64gp檢出率也均為100%。blaOXA-23和OXA-51型變異體OXA-66型酶基因為本院階段性MDRAB菌株攜帶的最主要的碳青霉烯酶，是導致耐藥性傳播的主要基因型。替加環素是一類新型的甘氨酰環類抗生素，體外藥敏結果顯示它對包括多重耐藥菌在內的革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均具有良好的抗菌活性，因此成為目前代替碳青霉烯類抗菌藥物的“最后選擇”[15],可作為本院MDRAB耐藥菌感染治療的首選藥物。

鮑曼不動桿菌為條件致病菌，環境適應性強，具有較強獲得耐藥性和克隆傳播的能力，培養陽性后應根據臨床癥狀、影像學等其他檢查結果綜合分析判斷其致病性。準確及時的分子流行病學監測，對于控制院內MDRAB感染暴發流行，及時準確查找傳染源具有重要意義。