兒童中性粒細胞功能異常的臨床特點研究

夏 敏,鄭 月，許無恨，肖詠梅，張 泓

(上海市兒童醫院/上海交通大學附屬兒童醫院 1.檢驗科；2.消化科,上海200040)

慢性肉芽腫(chronic granulomatous disease;CGD)是以皮膚、肺及淋巴結廣泛肉芽腫型損害為特點的遺傳性粒細胞殺菌功能缺陷病。由于CGD患兒存在著NADPH氧化酶的某些成分缺失或減少，不能有效地產生具有殺菌活性的超氧陰離子及其代謝產物，從而吞噬細胞無法產生“呼吸爆發”，即中性粒細胞功能異常。一種通過流式細胞儀檢測二氫羅丹明123轉變成羅丹明123的診斷方法則被認為是一種客觀、敏感、快速診斷CGD的方法[1]，且逐漸引關注。CGD的臨床表現非常復雜，本研究擬通過流式法測定中性粒細胞功能，以分析異常兒童的發病特點和臨床表現，完善相關基因檢測，進一步明確診斷，避免漏診。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2014年10月-2019年12月通過流式細胞法檢測顯示中性粒細胞功能異常患兒共41例，其中男28例，女13例，年齡23天-13歲，中位年齡3歲，住院35例，門診6例；住院科室依次為呼吸科13例、腎臟免疫科6例、消化科8例、PICU 4例、新生兒科3例、血液科1例；門診共6例：其中免疫門診4例，兒內科門診2例。健康成人和兒童的中性粒細胞可以被PMA激活，活化細胞均>90%，因此，在衡量中性粒細胞活化功能時一般以PMA刺激后活化細胞>90%為正常，流式法中性粒細胞功能異常判定標準為PMA刺激后活化率<90%或刺激指數<100[2]。

1.2 流式法測定中性粒細胞功能

1.2.1試劑與儀器

二氫若丹明(dihydrorhodamine，DHR)(Invitrogen，美國)，工作液濃度1∶100；佛波脂(phorbol myristate acetate，PMA)(Sigma，美國)，工作液濃度1∶3 000；流式細胞儀(FACS calibur，BD,美國)。

1.2.2樣本處理

每次檢測均使用一個正常兒童標本同時進行。抽取1-2 ml肝素抗凝血，混勻，室溫，24 h內檢測。分別標記二管為PBS對照管和PMA刺激管，每管中加全血50 μl在管底，不要碰到管壁。對照管中加入50 μl PBS，刺激管中加入50 μl PMA，混勻，37℃水浴箱中孵育15 min。加DHR123 25 μl，混勻，37℃水浴箱中孵育5 min(避光)。每管加1 ml溶血素，室溫避光10 min，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入4 ml PBS洗滌1次，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加500 μl PBS。

1.2.3數據分析

樣本上流式細胞儀，應用CELLquest軟件進行數據分析。先用PBS對照管進行設置，用前向角和側向角調整至粒細胞可以清晰地顯現(圖1A)。中性粒細胞設門，并在以FL1(熒光1)為橫坐標的直方圖上調整電壓將陰性對照控制在101之內，收集所有的對照管和刺激管的數據，每管樣本收集10 000個細胞。分析時，用前向角比側向角在門內將粒細胞挑選出并在特定區域內顯示，若丹明熒光柱狀圖在門內獲得，記錄PBS濃度百分比、PMA刺激后百分比和刺激指數。

1.3 統計學分析

所有數據分析使用SPSS 16.0統計軟件。兩組樣本均數比較采用兩獨立樣本的t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特點

回顧性分析的中性粒細胞異常患兒共41例，其中男28例，PMA值為61.79±26.5，女13例，PMA值為66.39±17.7，男女比例為2.2∶1。年齡大于3歲多見，<3歲組和≥3歲組PMA值分別為58.2±22.5和66.2±25.2，可見性別和年齡均無統計學差異(表1)；41例中僅6例送檢基因檢測，陽性者4例，分別是ARMC4、NCF2、PRTNB和CYBB(見表1)。

表1 41例中性粒細胞功能異常患兒一般資料

中性粒細胞異常者多與慢性肉芽腫高度相關，但本研究中臨床癥狀各異，多表現為反復肺部感染、各組織膿腫、膿毒血癥和關節炎等，因患兒分散在各科室，不易引起重視，很多未能送檢基因檢測而錯失進一步診斷明確的機會，漏診率高(表2)。

表2 41例中性粒細胞功能異常患兒臨床特點

2.2 流式圖特點

文獻報道，健康成人和兒童的中性粒細胞可以被PMA激活，活化細胞均>90%，因此，在衡量中性粒細胞活化功能時一般以PMA刺激后活化細胞>90%為正常。圖1中A為FSC/SSC散點圖，以中性粒細胞設門，圖1B為正常人經PMA刺激后其DHR峰值右移，活化>90%，圖1C為一CGD患兒經PMA刺激后直方圖上DHR峰值幾乎未有變化。

圖1 FSC/SSC散點圖、正常人、CGD患兒流式圖(A、B、C)

2.3 慢性肉芽腫家族流式圖

以下是一個CGD家族的患兒、患兒母親及患兒父親同時應用流式檢測DHR的分析圖。該家系中，圖2為CGD患兒，DHR試驗結果顯示幾乎無活性；圖3為母親呈現雙峰表現，考慮為攜帶者，此為X-link的CGD表現；圖4為患兒父親，PMA刺激后DHR顯示活性>90%，為正常，具體PMA和刺激指數見表3。

圖2 CGD家族流式圖(患兒)

圖3 CGD家族流式圖(患兒母親)

圖4 CGD家族流式圖(患兒父親)

表3 CGD家族PMA活性和刺激指數

3 討論

中性粒細胞是人體防御的重要組成部分，參與機體的非特異性抗感染過程。中性粒細胞在被激活過程中，其NADPH氧化酶也被活化，發生“呼吸爆發”(respiratory burst),即指中性粒細胞在受刺激活化時，短時間內產生大量超氧離子等過氧化物，發揮殺菌作用。因此，中性粒細胞氧化和吞噬功能的測定可對臨床診斷提供幫助，特別是在由于各類酶缺陷而造成中性粒細胞殺菌活性障礙的慢性肉芽腫疾病的診斷上。慢性肉芽腫病(CGD)是一種罕見的遺傳性免疫缺陷，發病率為1/20萬人[3]，與反復細菌感染，肉芽腫和死亡率增加有關。CGD分為x連鎖的隱性遺傳或常染色體隱性遺傳兩種，XL-CGD在中國占大多數病例，對某些感染的敏感性高于AR-CGD[4]。研究發現由gp91-phox基因突變引起的稱為XL-CGD，而由p22-phox、p47-phox和p67-phox基因突變引起的稱為AR-CGD[5]。

CGD患兒存在著NADPH氧化酶的某些成分缺失或減少，不能有效地產生具有殺菌活性的超氧陰離子及其代謝產物，如過氧化氫、氫氧根離子和次氯酸等，從而吞噬細胞無法產生“呼吸爆發”。因此它的特征是吞噬細胞(嗜中性粒細胞，單核細胞等)無法產生活性氧(ROS)，ROS是吞噬細胞殺微生物的主要組成部分[6]。無熒光的染料DHR123在中性粒細胞受 PMA刺激產生的大量超氧離子作用下被還原為具有熒光的羅丹明，通過流式細胞儀可直接檢測受PMA刺激后中性粒細胞的熒光強度[7]。DHR分析可幫助快速診斷CGD[8]，但非典型結果應與臨床表現，遺傳分析和定期隨訪相結合，一些CGD患者的非典型臨床表現可能會使DHR活性數據的基因型與表型相關性具有挑戰性。遺傳測試雖然對確認診斷有用，但可能需要數周的時間，在某些患者中無法提供結論性的答案。

CGD特點是皮膚、肺和淋巴結反復發生感染，肝膿腫及骨髓炎也較常見，胃壁局限性肉芽腫可致胃竇狹窄。此外，尚可引起視網膜損害、慢性腹瀉、肛周膿腫和腦膿腫等。患兒一般發育延遲。結合本研究中回顧性地分析了中性粒細胞功能異常的患兒，發現絕大部分患兒臨床均表現為反復肺炎、膿腫、反復和嚴重的膿毒血癥等，但因為患兒散落在各科室，絕大部分患兒未能施行進一步的基因檢測，從而延誤了診斷，一方面源于部分臨床醫師對于CGD認識不足，一方面患兒分散而不集中缺乏統一管理，遺憾未能基因明確診斷，甚至使得部分患兒錯失了造血干細胞移植等治療的機會，本研究結果反映了現在真實的狀況，提醒一定要及時溝通，特別對中性粒細胞功能異常的患兒，爭取進一步進行慢性肉芽腫的基因檢測以明確診斷。

另有研究表明，根據臨床表現和NADPH氧化酶的功能可CGD可分成3種亞型[9]，正是由于3種亞型的存在，使得CGD的臨床表現非常復雜，嚴重的幼年即發病，而癥狀較輕者直至青少年或成年后才發病并確診。事實上，這些分類都是相對而言，不能將基因型與吞噬細胞的表型或臨床表現完全一致的聯系起來。正是因為中性粒細胞功能異常復雜多變的臨床表現，更應增強兒科醫師對CGD疾病的認識，繼續完善基因檢查，避免漏診誤診，延誤治療。

總之，中性粒細胞功能異常患兒分布于各科室，臨床幾乎均出現反復、嚴重感染、預后差等特點，與慢性肉芽腫病高度相關，易漏診，需基因檢測進一步明確診斷。