CYP27A1抑制膀胱癌細胞增殖及作用機制研究

景中民，朱海松，徐海亮，張 超

(駐馬店市中心醫院 泌尿外科,河南 駐馬店463000)

膀胱癌是泌尿生殖系統中最常見的惡性腫瘤之一，男性膀胱癌的發病率為女性的3-4倍[1-2]。雄激素受體(AR)是雄激素配體調節的轉錄因子，雄激素-AR信號通路在膀胱癌的發生發展中起重要作用，這可能是膀胱癌發病率性別差異的原因[3-4]。線粒體膽固醇27-羥化酶(CYP27A1)，是細胞色素P450氧化酶家族的一員，可將膽固醇轉化為27-羥基膽固醇(27-HC)。CYP27A1的表達與多種腫瘤的增殖相關，例如前列腺癌、乳腺癌和結直腸癌[5-7]。此外，27-HC作為膽固醇代謝物，是一種選擇性的雌激素受體調節劑，調節體內膽固醇平衡并進一步影響細胞增殖[8]。在乳腺癌中，27-HC作為雌激素受體(ER)調節劑被首次發現，可以激活ERs和增加ER(+)乳腺癌細胞增殖[9-10]。然而，在前列腺癌中，27-HC對細胞增殖的影響是有爭議的。有報道在前列腺上皮細胞中27-HC促進了未轉化細胞的增殖與ER和AR相關[11]。CYP27A1在膀胱癌中的表達水平和CYP27A1/27-HC與膀胱癌增殖之間的關系尚未明確。因此，本文研究CYP27A1對膀胱癌細胞增殖的影響及具體的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞系 T24、5637和293T細胞系購于中國醫學科學院基礎醫學院細胞資源中心，細胞培養在含有10%胎牛血清(Gibco公司，美國)和1%青霉素/鏈霉素(碧云天生物技術研究所，江蘇)的DMEM培養基(Gibco公司，美國)中，放置37℃，含有5%CO2的恒溫箱中培養。

1.1.2試劑 總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購于日本TaKaRa公司；BCA蛋白定量試劑盒購于碧云天生物技術有限公司；CYP27A1、β-actin單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；噻唑藍(MTT)粉末和二甲基亞砜(DMSO)購于北京索萊寶公司；CYP27A1-pcDNA3.1由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；CYP27A1/27-HC購于美國圣克魯斯生物有限公司；檢測27-HC的ELISA試劑盒購于上海澤葉生物技術有限公司；BALB/c裸鼠購于北京維通利華公司。

1.2 實驗方法

1.2.1穩定細胞系的構建 CYP27A1-pcDNA3.1插入質粒pLVX-IRES-Puro中，采用分子生物學技術獲得質粒CYP27A1-pLVX-IRES-Puro。pLenti pLVX-IRES-Puro載體(1 μg)或pLenti CYP27A1-pLVX-IRES-Puro(1 μg)與psPAX2(1 μg)和pMD2.G載體(0.5μg)共轉染，加入293T細胞中并進一步培養。細胞培養48 h后，收集病毒上清液，以1 500 rpm離心5 min。在病毒上清液中加入8 μg/ml聚凝胺，然后轉染至T24細胞。轉染24 h后，用2 μg/ml嘌呤霉素選擇過表達CYP27A1-或pLVX-細胞，產生穩定的細胞系T24-CYP27A1和T24-pLVX(T24-Control)。

1.2.2qRT-PCR 根據試劑盒說明書提取細胞中總RNA，反轉錄為cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明進行實時定量PCR。每種基因的表達變化用 ΔΔCt 法計算，以管家基因 GAPDH的 mRNA 水平作為內參照。引物設計如下：CYP27A1上游引物序列5′-AGCTGCGCTTCTTCTTTC AG-3′，下游引物序列5′-GCTCCATGTCGTTCCGTA CT-3′，AR上游引物序列5′-AAGGCTATGAAT GTCAGC CCA-3′，下游引物序列5′-CATTGAGGCTAGAGAGCAAGGC-3′。引物由北京華大基因有限公司合成。

1.2.3Western blot實驗 提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術有限公司)定取30 μg蛋白。制作10%的分離膠和5%的濃縮膠，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉至PVDF膜上。切取目的蛋白，用5%脫脂奶粉封閉、一抗過夜孵育、TBST溶液清洗3遍、二抗室溫孵育1 h、TBST溶液清洗3遍。配置一定量的顯影液，均勻滴加在膜上，至于Amersham Imager600凝膠成像系統中拍照。

1.2.4MTT實驗 采用不同的處理方式，處理細胞后檢測細胞的增殖情況。每個處理組設置6個平行孔，20 μl MTT溶液加入檢測孔中，繼續孵育4 h。然后去除上清，每孔加入150 μl DMSO，震蕩5 min然后用酶標儀檢測570 nm處的吸光度值(OD)。

1.2.5裸鼠移植瘤模型 14只雌性BALB/c裸鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，6-8周齡，待其體重平均增至20 g時，隨機分成兩組。收集T24-CYP27A1和T24-Control細胞，用PBS制成細胞懸液，以200 μl含有100萬個細胞的密度接種至裸鼠右側腋窩皮下。待接種后的第10天開始測量裸鼠移植瘤的體積，以后每3天測量1次，直至第34天將裸鼠處死，取出瘤子并稱重。瘤子體積的計算公式為V=ab2/2(a為瘤子的長徑，b為瘤子短徑)單位mm3。

1.2.6ELISA實驗 用RIPA裂解樣品，裂解液(10 μl)或將標準樣品(10 μl)與稀釋緩沖液(40 μl)預混合，放在37℃下孵育30 min，用緩沖液洗滌96孔板，添加鏈霉抗生物素蛋白-HRP。將96孔板放在37℃恒溫箱中靜置30 min，然后用緩沖液洗滌3次。加入100 μl四甲基聯苯胺(TMB)底物溶液觀察，96孔板避光放置37℃孵育10 min，每孔加入50 μl終止液停止反應。放置酶標儀上在450 nm處檢測吸光度值，根據標準曲線計算出27-HC的水平。

2 結果

2.1 膀胱癌細胞中CYP27A1的mRNA水平T24細胞中AR表達水平較高，而CYP27A1的表達水平低，5637細胞中AR表達水平較低，而CYP27A1的表達水平高。AR在膀胱癌的發生和進展中起關鍵作用，所以選用T24細胞進一步研究CYP27A1與膀胱癌的關系，見圖1。

圖1 膀胱癌細胞中CYP27A1的mRNA水平

2.2 CYP27A1抑制膀胱癌細胞增殖將pLenti pLVX-IRES-Puro和pLenti CYP27A1-pLVX-IRES-Puro轉染至T24細胞后，從mRNA水平(A)和蛋白質水平(B)檢測，T24細胞穩定表達CYP27A1。CYP27A1高表達的細胞與對照細胞相比，明顯抑制了細胞的增殖(C)。裸鼠移植瘤模型中，CYP27A1高表達組瘤子的體積(E)及重量(F)明顯小于對照組，見圖2。

圖2 CYP27A1抑制膀胱癌細胞增殖

2.3 CYP27A1促進細胞分泌27-HC并抑制膀胱癌細胞增殖ELISA實驗檢測到CYP27A1高表達細胞分泌27-HC的量明顯高于對照組(A)，MTT實驗檢測27-HC可抑制膀胱癌細胞的增殖(B)，見圖3。

3 討論

CYP27A1是一種細胞色素P450氧化酶，主要作用是調節體內膽固醇平衡和維生素D3代謝[12-13]。AR是配體調節的轉錄因子，在膀胱癌發生發展中起重要作用[3-4]。有研究顯示，在不同分級的膀胱癌臨床標本中AR表達之間沒有差異[14]，但也有一些獨立研究表明，雄激素-AR信號可以增加膀胱癌細胞的增殖[4]。此外，膀胱癌細胞中AR敲低后可導致細胞凋亡[15]，AR與膀胱癌有一定的相關性。因此，選用AR陽性膀胱癌細胞系研究CYP27A1與膀胱癌之間的關系具有可行性。

CYP27A1可將膽固醇轉化為27-HC，分泌到細胞外進而影響細胞增殖[8]。但在前列腺癌和乳腺癌中，27-HC對細胞增殖的影響是不同的[8]。在乳腺癌中，27-HC可以增加ER(+)乳腺細胞增殖[9-10]。然而，在前列腺癌中，27-HC對細胞增殖的影響是有爭議的[5,11]。我們主要選用AR陽性的膀胱癌細胞研究CYP27A1對膀胱癌細胞增殖的影響，并對其作用機制做進一步研究。本文選用AR高表達，CYP27A1低表達的膀胱癌細胞T24研究CYP27A1對胱癌細胞增殖的影響，首先采用轉染的技術使T24細胞穩定表達CYP27A1，并在mRNA水平和蛋白質水平做了檢測，確保CYP27A1的高表達。通過MTT實驗發現，CYP27A1高表達的T24細胞的增殖能力與對照組相比明顯減弱，在裸鼠移植瘤模型中，CYP27A1高表達組瘤子的體積及重量均小于對照組，體內和體外實驗均表明CYP27A1可抑制膀胱癌細胞的增殖。CYP27A1可將膽固醇轉化為27-HC，經ELISA實驗檢測到，CYP27A1高表達組中27-HC分泌量明顯高于對照組。采用外源性的27-HC作用于T24細胞，結果顯示27-HC可明顯抑制細胞增殖。因此可得CYP27A1通過分泌27-HC，進而抑制膀胱癌細胞增殖。