維生素B12對皮膚損傷創面干預實驗研究

趙悅辰,楊小玉,杜昊睿,王鐵君*,王嘉鵬,夏雪怡

(1.吉林大學第二醫院 放療科，吉林 長春130041;2.吉林大學第二醫院 骨科，吉林 長春130041;3.吉林省一汽總醫院 骨科，吉林 長春130011;4.吉林大學第二醫院 眼科手術室，吉林 長春130041)

皮膚是人體最大的器官，具有免疫監視、損傷防御及調節體液平衡等多種生理功能，是人體與外界環境之間天然保護屏障。在外傷、手術等因素作用下，皮膚及其深部組織受到機械性損傷會導致皮膚缺損及功能喪失，從而引起外界細菌、真菌、病毒等微生物通過創傷部位進入機體，造成創傷感染，甚至敗血癥等全身感染[1-2]。正常情況下，在皮膚屏障被破壞后,機體會調動免疫細胞、干細胞、成纖維細胞等對皮膚缺損處進行修復，但在修復程中,如果各種因素不能得到有效協調,則會發生遷延不愈等情況。因此，如何采取有效措施促進創傷修復、減少疤痕形成一直是皮膚損傷治療中的重中之重。維生素B12是一種重要的生物活性物質，是細胞合成核酸過程中的重要輔酶，能夠催化分子重排、核苷酸生成脫氧核苷酸、轉甲基等反應。同時，維生素B12又是RNA合成不可缺少的物質，能夠加快肉芽組織增生及上皮細胞增殖，對受損皮膚黏膜上皮細胞及血管內皮細胞具有較強的修復再生功能，對受損的神經鞘具有營養和促進修復作用[3-4]。目前維生素B12主要應用于治療惡性貧血、神經炎、神經萎縮等疾病。近年來研究發現，維生素B12對創傷、放射性皮膚損傷等也具有一定作用，但其具體治療效果未深入研究。因此本研究利用小型香豬全皮層損傷作為動物模型，通過維生素B12軟膏對創傷進行治療，研究維生素B12軟膏對皮膚創傷的修復作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

小型香豬3只，6-7月齡，體重15±2 kg，雌雄不限。飼養于吉林大學基礎醫學院動物實驗中心標準動物室(22℃)。自然照明條件下，實驗動物自由攝食、飲水。

1.2 皮膚創傷模型建立及干預方法

在實驗前1天，剔除香豬背部位毛發。以3%戊巴比妥鈉靜脈注射進行麻醉，隨后利用75%乙醇對背部位皮膚進行消毒，采用直徑25 mm的取皮器并排在實驗動物背部制備3個直徑為25 mm的圓形創面，深達皮下組織全層，勿傷及皮下筋膜層。實驗動物背部單側從頭至尾3個創面依次設為Control組，三乙醇胺組，維生素B12組。維生素B12軟膏組每日涂抹復方維生素B12軟膏Ⅱ號(主要成為維生素B12，硫酸慶大霉素)進行藥物干預，三乙醇胺組每日在創口涂抹比亞芬燙傷膏(法國Biafine Act)進行藥物干預，Control組不作任何涂抹。

1.3 創口觀察及愈合率計算

在皮膚創傷模型建立后，于0、5、9、13、21、25及29天，用數碼相機拍攝皮膚傷口照片，同時利用Image-pro plus 6.0軟件對圖片進行處理，測量創口面積及創口愈合率，創口愈合率按如下公式計算：創口愈合率=[(A0-At)/A0]×100%，其中A0表示創面初始面積(t=0)，At表示不同時間點實驗動物的背部創口面積。

1.4 標本取材及組織學分析

術后29天，處死實驗動物并取下創口皮膚樣本，用切割器仔細修剪。新鮮組織塊樣本在4%多聚甲醛固定24 h以上，對組織進行依次梯度酒精脫水及石蠟包埋處理。利用石蠟切片機將組織切成厚度為4 μm的薄片。隨后對組織切片進行HE染色、Masson染色，并在正置光學顯微鏡下觀察組織樣本結構變化。

1.5 透射電子顯微鏡分析

在4℃條件下，利用4%戊二醛0.1 M磷酸鹽緩沖液對皮膚組織樣本固定2-4 h，隨后組織標本在1%四氧化鋨溶液中繼續固定2-4 h。通過醋酸鈾酰水溶液對組織樣本染色1 h，隨后醇類逐級脫水并將組織樣本用包埋劑包埋。將處理后組織塊切割成0.5-1.0 μm厚的薄片，依次通過甲苯胺藍、醋酸鈾和枸櫞酸鉛對組織片進行染色，染色時間為15 min，室溫干燥過夜。最后在透射電子顯微鏡下觀察組織標本的超微結構。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 皮膚創口外相及創口愈合率

為了對不同實驗組小型香豬表皮創口愈合情況進行分析，我們分別于不同時間點對皮膚創口進行觀察并使用Image-pro plus 6.0軟件對愈合率進行測量。如圖1、2所示，術后第13天之前，各組實驗動物造模處均可見明顯缺損，皮膚愈合較為緩慢。從第17天開始，與Control組相比，三乙醇胺組和維生素B12組表皮創口明顯減小，愈合率顯著提升。隨著時間的推移，三乙醇胺組和維生素B12組繼續保持這種良好的修復效果。術后29天后，在所有組中，Control組創口愈合情況最差，創口表面存在大面積缺損，創面愈合僅約50%。與Control相比，維生素B12組、三乙醇胺組創口愈合率顯著提高(P<0.05)。維生素B12組創口已接近完全愈合，愈合率高達93.5%，創面基本完全被新生皮膚組織所取代。相比于維生素B12組，三乙醇胺組創口治療效果略差，創口愈合率為87%，創口部位仍有少許瘢痕存在。最后我們應用Image-pro plus 6.0軟件測量術后29天各組實驗動物的相對創口寬度。結果顯示(圖3)，與Control組相比，三乙醇胺組相對創口寬度無顯著差異(P>0.05)，維生素B12組相對創口寬度顯著減小(P<0.05)。

圖1 不同時間點各組實驗動物表皮創傷外相

圖2 各實驗組表皮愈合曲線

圖3 各組實驗動物表皮創口相對寬度

2.2 皮膚創傷模型中各組的組織學改變

皮膚創傷的愈合涉及多種細胞、組織及體液因子參與，這一過程主要包括肉芽組織增生、上皮化生及皮膚附屬器官的再生。這些組織學的變化可通過HE染色進行觀察。如圖4所示，在所有實驗組中，新生表皮組織均缺少腺體、毛囊等皮膚附屬器官。在Control組中可見大量結痂形成，新生組織結構較為疏松。與Control組相比，維生素B12組及三乙醇胺組皮下組織更為致密，證明創傷修復效果更佳。特別是在維生素B12組，細胞外基質有序程度明顯優于其他各組，且與原有組織之間并無明顯的分界線，證明新生組織融合度更高。在創傷愈合過程中，缺損部位會產生大量膠原纖維以填補缺損部位，Masson染色是評估組織膠原纖維含量的常用手段，如圖5所示，新生皮膚組織中膠原纖維被染為藍色，在Control組及三乙醇胺組中膠原纖維排列較為混亂無序，且含量較少。相比之下，在維生素B12組可見更多膠原纖維形成，并且排列較為有序。因此，通過HE及Masson染色可推測維生素B12軟膏能顯著促進皮膚組織再生及膠原沉積。

圖4 HE染色對創面再生進行組織形態學分析

圖5 Masson染色對創面膠原沉積情況進行分析

2.3 透射電鏡觀察組織的超微結構

為了一進步評測復方維生素B12軟膏對皮膚創口愈合的影響，我們通過透射電子顯微鏡觀察各組皮膚組織的超微結構變化。由圖6可見各組膠原纖維呈管狀結構排列，排列規則程度和膠原纖維間隙大小具有一定差異性。維生素B12組中，可見橫向截面膠原纖維間隙較小、排列致密，縱向截面膠原纖維排列較規則。在Control組、三乙醇胺組中，橫向截面膠原纖維間隙較大、排列較稀疏，縱向截面膠原纖維排列規則程度也略低于維生素B12組。通過透射電鏡結果證明維生素B12軟膏表皮修復效果最好，新生皮膚中膠原纖維排列分布更為有序，接近于正常皮膚組織。

圖6 各組實驗動物表皮組織的透射電鏡照片

3 討論

皮膚作為人體最大的器官，在維持體液平衡和保護內臟免受外界損傷方面有重要作用。燒傷、燙傷、撕裂和手術造成的皮膚創傷是全世界最重要的健康問題之一，可發生在身體的各個部位。嚴重的皮膚創傷往往伴有創面部位的感染，會阻礙創面的正常愈合并導致更嚴重的循環癥狀，嚴重者甚至可能死亡[5-7]。因此，如何有效緩解皮膚創傷患者癥狀并提高創傷修復率成為目前亟待解決的重要問題。在皮膚創傷治療中，局部藥物治療應用最為廣泛，對機體副作用較小，并且創口部位藥物濃度高[8]。目前應用于皮膚創傷局部治療的藥物種類很多，如維生素、三乙醇胺、類固醇乳膏等，這些藥物在療效上存在一定的差異，目前尚無標準的治療方案。

本研究中應用復方維生素B12軟膏Ⅱ號對皮膚創傷進行治療并評測其臨床應用價值。這種維生素B12軟膏的作用為止癢鎮痛、抗菌及修復血管內皮細胞損傷,是當前治療皮膚、粘膜損傷的有效藥物之一。在維生素B12軟膏中的慶大霉素成分是氨基糖苷類抗菌藥物的一種，具有廣譜的抗菌效果，能夠有效抑制綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌等致病菌的生長，尤其對于革蘭氏陰性菌具有極強的殺傷效果，可防止皮膚創口感染的發生，提高皮膚創口愈合率[9]。此外，相對于其他抗菌藥物，慶大霉素不會使致病菌產生較強的耐藥性。而維生素B12又稱為氰鈷胺，其對機體組織蛋白及脂類的合成及代謝具有重要作用[10]。體內維生素B12代謝水平的改變可能會導致白癜風、口腔炎、特應性皮炎、痤瘡等皮膚疾病的發生[11-12]。在皮膚吸收維生素B12后，皮膚中RNA合成速率有效增強，加速損傷部位皮膚粘膜及血管的再生。此外，維生素B12可降低皮膚敏感性，抑制組織增生反應，還具有止癢鎮痛及預防血管痙攣的作用[13]。本研究成功建立了小型香豬皮膚創傷模型，利用復方維生素B12軟膏對皮膚創口進行治療，同時與一種臨床常用的皮膚創傷治療藥物三乙醇胺進行療效對比。表皮創傷外相及愈合率評分顯示利用維生素B12軟膏對皮膚創口進行治療后，創口表皮愈合率明顯高于三乙醇胺治療組，維生素B12軟膏有效促進了表皮損傷后組織再生的愈合速率。通過組織學觀察，維生素B12組創面新生部位較為平整，組織排列有序，并且有大量膠原沉積。相比于其他各組，維生素B12組新生組織表面結構接近于正常皮膚，愈合程度明顯優于三乙醇胺組。

綜上所述，維生素B12軟膏能夠加速皮膚創傷的愈合速率，有效促進皮膚組織的再生及膠原沉積，在皮膚創傷臨床治療中具有有巨大的應用前景。