信號素蛋白4D/叢蛋白B1通道參與動脈粥樣硬化形成的研究進展

黃 菊，王立平，楊昆鵬，陳冬雪，趙 鵑*

(1.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院 心內科,黑龍江 哈爾濱150001;2.中國人民大學醫院 放射科,北京100872)

動脈粥樣硬化(AS)導致的急慢性心血管事件死亡率占居民疾病死亡構成的40%以上，位居第一，據估計我國心血管病現患人數約2.9億人，已成為重大公共衛生問題[1]。信號素蛋白4D(Sema4D)因參與軸突生長調控而被發現[2]，近年來發現Sema4D及其受體叢蛋白B1(PlexinB1)均可在AS斑塊中表達[3]，但對AS具體影響機制尚不明確，本文整合近年來文獻，通過對其結構、特點、功能等進行分析，探討Sema4D/PlexinB1通路的作用機制，闡明其在AS發生發展過程中的生理學意義。

1 Sema4D蛋白結構與分布

信號素蛋白(Semaphorins)家族是一類以結構中具有Sema區域為共同特征的蛋白，在人和病毒的鑒定中，Semaphorins家族有超過30個組成成員，根據結構與功能分為8個亞類[4]；Sema4D(CD100)屬于IV類Semaphorins家族成員，是以同源二聚體模式存在于細胞膜的一種Ⅰ型跨膜糖蛋白[5-6]，非還原模式下分子量300 kDa,還原模式下150 kDa。

Sema4D蛋白組成包括：胞外N末端、Sema結構域、半胱氨酸富集區域(CRD)、免疫球蛋白樣結構域(Ig)以及胞漿內的尾部結構，胞外部分還包括多個N-連接糖基化位點，用于形成亞基內二硫鍵[7]；Sema4D主要分為膜結合型和可溶性兩種模式[5]，膜結合型Sema4D胞內部分存在1個蛋白水解位點[8]，當T細胞或血小板被激活時，Sema4D被金屬蛋白酶ADAM17(TACE)水解，從細胞表面脫落從而產生具有活性的可溶性Sema4D(sSema4D)外域片段，其分子量非還原模式下240 kDa，還原模式下120 kDa，該片段可結合并激活其受體并保留在循環系統中[6-7]。

Sema4D分布廣泛，在T細胞、B細胞、NK細胞、單核巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞、血小板表面等均有表達，靜息的淋巴細胞表面的Sema4D可在細胞活化后表達增加，除此之外多種腫瘤的細胞系也可表達Sema4D，并可以自分泌形式分泌于腫瘤微環境發揮作用[7]；Sema4D最初因作用于神經系統中誘導軸突生長，參與神經元網絡構建而被發現，隨著研究深入發現Sema4D在腫瘤侵襲、免疫反應、細胞遷移、血管生成等過程中也起著關鍵作用[2，9-11]；最近的一研究表明，Sema4D在人AS斑塊中表達，尤其是在巨噬細胞和泡沫細胞中表達，這揭示出Sema4D可能參與內皮功能障礙、脂質成分沉積等從而影響AS的發生與發展[3]。

2 PlexinB1蛋白結構與分布

PlexinB1是Plexins蛋白家族的一員，全長2 135氨基酸，其蛋白組成包括：胞外Sema結構域，3個PSI結構域，3個甘氨酸-脯氨酸(G-P)富集結構域，胞漿部分含有2個GAP(GTP酶活化蛋白)樣結構域，中間1個GTP酶(GTPase)結合結構域，胞質尾部有一個盤狀同源區域(PDZ)結合位點[8]。

PlexinB1是Sema4D的高親和力受體，最初發現于小鼠腎臟源性細胞[6]，其mRNA轉錄本在腎、甲狀腺、前列腺、腦、肺、乳腺、子宮、卵巢和肝臟等多種組織中均有一定水平的表達[12]；Basile等人發現PlexinB1在人和豬的內皮細胞高度表達，推測PlexinB1在AS形成過程中有著重要作用，兩者構成的Sema4D/PlexinB1通路也受到廣泛談論[13]。

3 Sema4D/PlexinB通路信號轉導途徑

Yoshida[6]等研究人員發現Sema4D二聚體分別獨立地結合到2個PlexinB1分子進行下游信號轉導并激活以下3條信號通路發生作用：①PlexinB1募集并激活MET(也稱C-Met)后，酪氨酸激酶導致MET及PlexinB1胞質區域部分磷酸化，從而參與血管生成等過程[13]；②募集并順序激活PYK2及Src后，可直接激活PI3K/Akt進行作用，或由PYK2協助促進PlexinB1蛋白C端與RhoGEF蛋白亞組的PDZ區域結合活化RhoGTP酶(RhoA)，激活或抑制GDP向GTP轉化，活化Rho并作用于下游分子ROCK和(或)mDIA1，誘導肌動蛋白絲延長進而實現細胞骨架的調控[13]；③PlexinB1的GAP區域活化后激活GTPase結構域，導致Ras蛋白(R-Ras)去磷酸化后短暫失活，進而參與下游信號轉導[14]。

4 Sema4D/PlexinB1通路與AS的形成與進展

AS是一種多危險因素共同作用導致的慢性疾病。Yukawa等研究人員通過實驗發現敲除載脂蛋白E缺陷型(ApoE-/-)小鼠中Sema4D基因可延緩AS的形成與進展，推測Sema4D可能通過參與內皮細胞損傷、單核細胞粘附遷移及其衍生的脂質負載的泡沫細胞形成，從而促進血管生成加劇AS斑塊不穩定性[15]。

4.1 血管內皮損傷

4.1.1影響血管內皮結構的完整性

血管內皮鈣黏蛋白(VE-cad)是位于內皮細胞粘附區的跨膜鈣粘蛋白，它在維持內皮細胞完整性、血管通透性和血管內環境的穩定性中起重要作用，血管生成過程中，內皮細胞觀察到的第1個變化即與β連環蛋白(β-catenin)有關的基于VE-cad改變造成的細胞間連接的破壞；Chen等[11]研究者在實驗中發現敲低Sema4D和PlexinB1可以抑制VE-cad表達，并觀察到細胞間連接被破壞；Yamamoto[17]等研究人員則在使用Sema4D刺激內皮細胞后觀察到β-catenin從細胞與細胞間接觸快速定位到細胞質中，導致基于VE-cad的內皮細胞收縮、細胞間裂隙形成，進而影響血管內皮通透性[8,16,17-18]。

4.1.2影響血管內皮功能的穩定性

一氧化氮(NO)是控制血管舒張的重要介質，且能借助其強脂溶性的特點，迅速擴散至血液，降低血小板活性及炎癥因子的表達，抑制血小板凝集和炎癥細胞向內皮細胞的粘附；而Sema4D可以通過PlexinB1途徑激活小膠質細胞表達誘導型一氧化氮合酶(iNOS)促使血管內皮細胞NO合成增加，提示Sema4D可能參與AS的形成發展[19-20]。

4.2 參與炎癥反應

AS的特征在于血管內膜中單核細胞和巨噬細胞蓄積,血管內膜中單核細胞水平可以評價臨床心血管疾病嚴重程度[21]；Luque等[3]研究人員通過實驗證實plexinB1在人單核細胞、巨噬細胞和泡沫細胞中表達，并作為單核細胞與內皮細胞(EC)耦合中促進細胞間接觸的多種粘附分子的一部分，介導了血液單核細胞內皮粘附及其向內皮下空間的遷移，由此推測阻斷Sema4D/PlexinB1通路可能有助于延緩單核細胞以及巨噬細胞的遷移并減少LDL的內皮下沉積[3]，從而延緩AS發生發展。Yoshida等[6]研究者通過研究發現sSema4D另一個重要的作用是可以誘導腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)的活化從而參與炎癥反應。有人發現sSema4D刺激的單核細胞表達更高水平的CD163，這表明sSema4D可能誘導單核細胞向M2樣表型極化，通過改變巨噬細胞的分化和表型，進而參與炎癥反應影響AS的發生發展[22]。

有研究者通過噬菌體展示實驗觀察到Sema4D/PlexinB1通路還可下調巨噬細胞表面清道夫受體脂肪酸轉位酶(CD36)，減少氧化低密度脂蛋白(oxLDL-C)與巨噬細胞結合，泡沫細胞生成減少[4，22-23]，提示Sema4D/PlexinB1通路可能存在一種特殊的抗AS作用。

4.3 參與AS斑塊內血管新生

斑塊內微血管新生可導致活性氧(ROS)產生和單核細胞浸潤增加從而加速斑塊生長并為單核細胞進入纖維帽加重斑塊易損性創造了條件[8,11]；Sema4D能夠通過介導內皮細胞遷移、管腔形成等促進血管發生。Chen[11]等在實驗中發現敲低Sema4D和PlexinB1后可以抑制人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中血小板內皮細胞粘附分子(CD31)，VE-cad和基質金屬蛋白酶2(MMP2)的表達，其中CD31是內皮細胞的生物標記，VE-cad是血管生成的起始要素，MMP2亦是血管生成所必需的[3]，證明了Sema4D具有促進血管生成的作用，并且有實驗證實Sema4D在體內外具有的血管生成作用不受其他血管生長因子上調介導[11，14]。

4.3.1誘導血管內皮形態發生和骨架重組

Conrotto等[8]認為MET介導的上皮細胞和內皮細胞募集作用，對促進血管形成有重要作用；實驗證實Sema4D在與PlexinB1結合后，通過募集并激活MET磷酸化可以促進毛細血管樣管的形成，同時在體外發芽實驗中發現Sema4D也可以引起HUVEC橢球形成大量萌芽；Sema4D/PlexinB1通路還可以誘導細胞骨架重組，通過激活Rho及一系列反應觸及肌球蛋白輕鏈磷酸化引起肌動蛋白應力纖維聚合，進而促進血管形成[15-18]。

4.3.2血管內皮細胞運動的發生

Chen[11]等研究者在transwell遷移分析實驗中發現當Sema4D在HUVEC中被敲低時，遷移減少了約30%，表明Sema4D能夠顯著促進HUVEC的遷移；傷口愈合試驗通過在內皮單層測量跨內皮電壓(TEER)也表明在體外重組的Sema4D以劑量依賴形式促進內皮細胞遷移[18]。

Wu[18]等研究者通過使用慢病毒介導破壞內皮細胞中PlexinB1的CRISPR/Cas9基因，發現PlexinB1表達的降低顯著阻斷了刺激作用下Sema4D對內皮細胞遷移的影響，這表明Sema4D通過PlexinB1通路發揮促進內皮細胞遷移的作用[15]。除Sema4D對PlexinB1的直接作用外，Sema4D/PlexinB1通路還可以通過募集并激活MET來促進內皮細胞遷移[24-26]。

4.4 血小板粘附微血栓形成

Sema4D表達缺失可通過降低血小板對血管損傷的反應，降低高血脂狀態下血小板高反應性，進而減少血栓的大小和閉塞的頻率[18]；Mou[27]發現缺乏Sema4D的小鼠在體內血管損傷后表現出延遲的動脈閉塞，證明了Sema4D可以影響血管微血栓形成；Sema4D介導的血小板活化聚集存在雙重機制，由于血小板既能表達Sema4D又能表達PlexinB1，所以最初附著在血小板表面的Sema4D可以充當血小板與血小板之間相互作用的配體進行初始化偶聯[9]，通過依賴于接觸的方式增加脾酪氨酸激酶(Syk)的活化來促進膠原誘導的血小板活化，從而促進血栓形成，隨著Sema4D在TACE介導下從血小板表面脫落，接觸增強作用減弱，Syk活化遭受抑制，從而抑制血小板聚集及血栓生長[27-29]。

5 抗Sema4D靶向治療方案

Sema4D最近被評估為炎性疾病和癌癥治療的靶標，目前，已經通過使用識別鼠、靈長類和人Sema4D分子的雜交瘤開發了人源化IgG4抗Sema4D抗體(名為VX15/2503)，Ⅰ期臨床試驗中表現出良好的治療耐受性；在向玻璃體內注射抗Sema4D抗體的實驗中發現：sSema4D可以誘導周細胞遷移和N-鈣粘著蛋白(CDH2)內在化，降低血管內皮覆蓋率增加血管通透性，從而影響內皮細胞功能[18]。在風濕性關節炎小鼠模型中，抗Sema4D治療的小鼠的疾病評分顯著降低，顯示出滑膜中炎性浸潤的減少以及較低的TNF-α和IL-6血清水平，此外，炎癥部位的血管生成也較少。這些實驗結果都表明抗Sema4D治療可以作為風濕性關節炎、AS等慢性炎癥疾病的新型治療策略[30-31]。

6 總結與展望

目前大多數流行的AS療法都僅針對傳統的危險因素而非AS本身，干預Sema4D/PlexinB1通路可能為AS引發的心血管事件診療提供新思路，若針對AS進行防治，抑制血小板活化、內皮細胞功能障礙及泡沫細胞形成，或可防止冠狀動脈粥樣硬化進一步惡化；從Sema4D等新型蛋白分子入手，深入研究其對AS發生發展的影響，也可以為心血管事件發生提供更高預測價值的靶點。