miR-34 與survivin 基因在人結腸癌組織中的表達及意義

王紅芳 余細球 葉靜 范昭

微小核糖核酸(miRNA)是一類高度保守的非編碼小分子核糖核酸(RNA),可以特異性結合靶細胞mRNA,調控靶基因的蛋白表達,參與腫瘤的發生發展［1,2］。其中miR-34 在很多腫瘤細胞系中表達缺失,從而導致細胞增殖、抗凋亡和轉移相關基因的表達增加,具有抑癌基因作用,如B 細胞淋巴瘤-2(bcl-2)、白細胞分化抗原44(cd44)、Noch1 等［3］。survivin 作為凋亡抑制蛋白,是miR-34a 的靶基因之一,在細胞增殖和凋亡平衡中發揮重要調控作用。本研究通過熒光定量PCR 技術,檢測miR-34 和survivin 基因在人結腸癌組織和癌旁組織中的表達情況,探討二者與結腸癌發生、發展的關系及作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 臨床資料和標本取自2015 年1 月～2017 年12 月深圳市羅湖區人民醫院和深圳市北大深圳醫院32 例患者手術切除的新鮮組織,其中32 份結腸癌組織(腺癌)標本作為癌癥組,32 份癌旁組織標本(據切緣＞2 cm)作為癌旁組,均經病理組織學證實,且在-80℃條件下速凍保存。其中男20 例,女12 例；年齡41～73 歲,平均年齡(59.2±6.1)歲。所有標本收集均得到醫院倫理委員會批準,獲得患者知情同意并簽字。

1.2方法

1.2.1總RNA 提取和miRNA 反轉錄 50 mg 組織剪碎后,按照Trizol(Invitrogen) 說明書提取總RNA,用分光光度儀檢測提取總RNA 含量和純度,抽提的RNA A260/A280為1.7～2.0。取 總RNA 1 μg,用SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR 試劑盒(TaKaRa)進行反轉錄：2×miRNA Reaction Buffer Mix 5 μl,0.1%BSA 1 μl,miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μl,用水補至10 μl,反應條件：37℃ 60 min,85℃ 5 s。反應結束后,用不含RNA 酶的水稀釋體系至50 μl,取1 μl 進一步做熒光定量 PCR。

1.2.2熒光定量PCR 分析引物均由上海生物工程有限公司合成,miR-34a 引物序列：tggcagtgtcttagctggttg ；miR-34b/c 引物序列：caatcactaactccactgccat；survivin 引物上游序列：cacctgaaagcttcctcgac,下游序列：tctaacctgccattggaacc；U6 引物上游序列：ctcgcttcggcagcaca,下游序列：aacgcttcacg aatttgcgt。

反應體系：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μl,上下游引物各1 μl(10 μM),cDNA 1 μl,用水補至20 μl 體系。每個樣本3 個復孔,以U6 作為內參,同時每個基因設立陰性對照。擴增條件：95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 30 s,40 個循環后95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s。

1.3觀察指標及判定標準 比較miR-34 和survivin基因在癌癥組和癌旁組中的轉錄表達水平。基因表達相對量采用癌癥組/癌旁組=2-△△CT進行計算,其中△△CT=△CT癌癥組(CT目的基因-CT內參)平均值-△CT癌旁組(CT目的基因-CT內參)平均值。

1.4統計學方法 采用SPSS17.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,采用t 檢驗；相關性檢驗采用Pearson 相關分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

miR-34a 和miR-34b/c 基因表達在癌癥組組織中均低于癌旁組,差異有統計學意義(P＜0.05)；在癌癥組組織中miR-34b/c 表達較miR-34a 水平降低更顯著,survivin 表達增加較癌旁組增高,差異有統計學意義(P＜0.05)；miR-34a 和miR-34b/c 與survivin 在結腸癌癌組織中表達水平呈顯著負相關(r=-0.43、-0.51,P＜0.05)。見表1。

表1 miR-34a、miR-34b/c 和survivin 表達水平(,%)

表1 miR-34a、miR-34b/c 和survivin 表達水平(,%)

注：與癌旁組比較,aP＜0.05；與癌癥組survivin 比較,bP＜0.05

3 討論

miR-34 可以抑制細胞生長,調節細胞周期,促進細胞衰老,誘導細胞凋亡,阻止細胞遷移等,被認為是抑癌基因,其家族包括miR-34a、miR-34b 和miR-34c,在不同的物種中均具有高度的保守性。人miR-34a 基因定位于染色體1p36.22,miR-34b 和miR-34c定位于染色體11q23.1,由同一初始轉錄子所編碼。研究發現,miR-34 的調控基因均位于基因組脆性位點區域,在腫瘤中這些區域染色體常發生擴增、缺失或重排,易造成基因表達的改變,從而促進多種疾病的發生,與許多惡性腫瘤的形成相關［3-5］。

隨著對miR-34 家族的研究深入,利用其可以調節多種蛋白抑制腫瘤生長這一生物學特點,已有研究把miR-34 家族作為治療惡性腫瘤的靶點［6］,而導入miR-34 類似物或其前體補充缺失的miR-34 功能,在體內外均可以抑制腫瘤細胞的生長,誘導其凋亡,且對正常組織和細胞沒有明顯的毒副作用,所以認為miR-34可作為惡性腫瘤的治療靶點,有極佳的應用前景［7,8］。但miR-34 在人結腸癌組織中的表達、調節和預后等缺乏系統研究,觀點也不盡相同。

研究發現miR-34 和結腸癌干細胞之間有聯系,miR-34 的丟失會引起結腸癌干細胞/祖細胞增多,導致癌細胞侵襲性發展［9］。在Wan 等［10］研究中,片仔癀可以通過上調miR-34c-5p 的表達來抑制結腸癌HCT-8 細胞增殖,使細胞周期阻滯在G0/G1 和S 期之間。與正常結腸黏膜組織相比,miR-34a 和miR-34b/c在結腸癌組織標本中表達下調；在結腸癌細胞系中表達缺失,這些與其啟動子區超甲基化有關［11］。這些研究都支持miR-34 作為抑癌基因在結腸癌中發揮作用。而Mudduluru 等［12］和Hiyoshi 等［13］的研究觀點相反,認為miR-34 在結腸癌中可能是癌基因。Hiyoshi 等［13］用定量RT-PCR 技術對159 例美國和113 例中國結腸癌和癌旁正常組織進行檢測,發現所有miR-34 家族成員在結腸腫瘤中表達均明顯增加；運用激光顯微切割技術,進一步發現miR-34b/c 在腫瘤間質組織中表達增加更顯著,該結果與結腸癌預后不良有關,推測miR-34 可能作為癌基因參與結腸癌進展。在本研究中,miR-34a 和miR-34b/c 在癌癥組中表達水平分別是癌旁組的56%和49%,均低于癌旁組,尤其miR-34b/c 更明顯,差異有統計學意義(P＜0.05),支持miR-34 家族在結腸癌組織中作為抑癌基因發揮作用。

survivin 基因是凋亡抑制蛋白基因家族中非常重要的一員,在大多數惡性腫瘤中都有表達,主要功能為促進腫瘤細胞增殖,抑制凋亡,維系二者之間的平衡。有研究顯示survivin 基因是miR-34a 作用的靶基因之一。在喉鱗狀細胞癌Hep2 中,miR-34a 過表達可以引起Hep2 細胞活力下降,凋亡增加,細胞遷徙和侵襲力降低；survivin 和Ki-67 基因表達水平也相應下調,認為miR-34a 在喉鱗狀細胞癌中是一個負性的miRNA,通過抑制survivin 和Ki-67 基因表達,抑制增殖和浸潤轉移,并誘導細胞凋亡［14］。在人膀胱移行細胞癌細胞(T24)中,miR-34a 表達量明顯低于正常人膀胱上皮細胞,穩定轉染miR-34a 類似物后,隨著T24 細胞中miR-34a 表達上升,Survivin 蛋白的表達明顯降低,細胞增殖、遷移和侵襲能力也顯著降低［15］。以上研究均支持miR-34a 通過抑制其靶基因survivin 調節細胞的生物學行為。

相關研究在人結腸癌組織中尚未見報道。在本研究中,miR-34a 和miR-34b/c 基因表達在癌癥組組織中均低于癌旁組,差異有統計學意義(P＜0.05)；在癌癥組組織中miR-34b/c 表達較miR-34a 水平降低更顯著,survivin 表達增加較癌旁組增高,差異有統計學意義(P＜0.05)；miR-34a 和miR-34b/c 與survivin 在結腸癌癌組織中表達水平呈顯著負相關(P＜0.05),與前面研究一致。

綜上所述,miR-34 家族在結腸癌中作為抑癌基因發揮作用,可以負性調節survivin 的表達,可以做為臨床診治結腸癌的的新靶點。