利用熒光探針檢測(cè)谷胱甘肽的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

陳黎艷， 程 瑩， 費(fèi) 崢

（華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，武漢 430079）

0 引 言

高等院校在國(guó)家創(chuàng)新體系中擔(dān)負(fù)著教學(xué)創(chuàng)新、科研創(chuàng)新、教育創(chuàng)新等職能，是國(guó)家培養(yǎng)創(chuàng)新人才的重要基地，因此，利用現(xiàn)有的各類教學(xué)資源和科研平臺(tái)為社會(huì)培養(yǎng)富有創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力的現(xiàn)代化人才是當(dāng)代高等院校的重要責(zé)任［1-4］。化學(xué)專業(yè)是一門以實(shí)踐為主的學(xué)科，化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)巧妙地融合了實(shí)驗(yàn)理論與實(shí)踐指導(dǎo)是培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)探索的意識(shí)和創(chuàng)新精神的重要途徑。相較于以操作技能培養(yǎng)和理論驗(yàn)證為目的的傳統(tǒng)基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)，綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生系統(tǒng)地完成基礎(chǔ)知識(shí)學(xué)習(xí)、文獻(xiàn)調(diào)研、數(shù)據(jù)分析和結(jié)果討論這樣一個(gè)完整的研究過程，這無(wú)疑對(duì)學(xué)生科學(xué)研究興趣和創(chuàng)造性思維的培養(yǎng)提供有力的幫助［5］。

熒光探針是一種利用光譜學(xué)變化對(duì)特定目標(biāo)分析物進(jìn)行識(shí)別的高效探測(cè)器［6-7］，本文依托于縱向科研項(xiàng)目，借助紫外可見分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)研究了熒光探針分子對(duì)生物活性物種谷胱甘肽（GSH）的識(shí)別性能［8］。在實(shí)驗(yàn)過程中學(xué)生的文獻(xiàn)閱讀、有機(jī)合成、儀器操作等技能得到了訓(xùn)練，創(chuàng)新思維和合作精神也得到了進(jìn)一步的培養(yǎng)。

1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)計(jì)

熒光探針技術(shù)可將分子間的相互作用轉(zhuǎn)化為易于監(jiān)測(cè)的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的變化，與傳統(tǒng)的高效液相色譜法、質(zhì)譜法、電化學(xué)檢測(cè)法等檢測(cè)方法相比，大大提高了靈敏度和準(zhǔn)確度。GSH是生物體內(nèi)具有生物活性的小分子生物硫醇，在細(xì)胞中參與基因調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和自由基清除等生理過程。然而，一旦GSH的含量超出細(xì)胞的正常水平，則會(huì)造成生物體氧化還原反應(yīng)失衡并對(duì)肝臟和腎臟代謝造成負(fù)擔(dān)。因此，GSH的定量和定性檢測(cè)對(duì)于生命科學(xué)和臨床診斷均具有重要意義［9-10］。羅丹明類熒光團(tuán)具有摩爾消光系數(shù)大、量子產(chǎn)率高、水溶性好等優(yōu)點(diǎn)，因此在各類探針分子的設(shè)計(jì)中應(yīng)用廣泛［11］。GSH中巰基的親核能力較強(qiáng)，可以與鹵素原子（如Cl，Br）發(fā)生親核取代反應(yīng)，因此碳鹵鍵成為GSH常見的識(shí)別集團(tuán)［12］。本文將α-溴代酰胺連接至羅丹明熒光團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了新型的識(shí)別GSH的熒光探針RHO（見圖1）。在探針與GSH反應(yīng)之前，羅丹明螺環(huán)關(guān)閉，氧雜蒽結(jié)構(gòu)處于非共軛體系，因此探針本身無(wú)熒光發(fā)射且體系無(wú)顏色。當(dāng)GSH進(jìn)攻α-溴代酰胺結(jié)構(gòu)之后，在氫鍵的作用下羅丹明的羅內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)開環(huán)，氧雜蒽結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為共軛體系，因此探針的熒光被打開，體系也隨之轉(zhuǎn)換成為肉眼可見的紅色（見圖1）。

圖1 熒光探針檢測(cè)GSH反應(yīng)機(jī)理

2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

(1)實(shí)驗(yàn)儀器。電子分析天平（LE104E，梅特勒托利多），恒溫磁力攪拌器（MYP19-2，上海梅穎浦儀器儀表有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Hei-VAP Core ML／G3，德國(guó)海道夫公司），核磁共振波譜儀（Bruker Mercury Plus 400 MHz，美國(guó)布魯克公司），手提式紫外燈（ZF-5，上海嘉鵬科技有限公司），熒光分光光度計(jì)（Cary Eclipse，安捷倫科技有限公司），紫外可見分光光度計(jì)（Cary 60，安捷倫科技有限公司）。

(2)主要試劑。羅丹明B酰肼（95%～98%，天津希恩思生化科技有限公司），溴代乙酰溴（≥98%，Sigma-Aldrich），無(wú)水碳酸鉀（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），氘代二甲基亞砜－d6（≥99%，Sigma-Aldrich）。

3 實(shí)驗(yàn)操作

(1)探針RHO的合成。將溴乙酰溴（3.0 mmol，606 mg）和無(wú)水碳酸鉀（3.0 mmol，414 mg）溶解于10 mL無(wú)水二氯甲烷中。將羅丹明B酰肼（2.0 mmol，912 mg）溶解于10 mL二氯甲烷并放置于恒壓低液漏斗，以15～20滴／min的速度滴加到反應(yīng)體系中。反應(yīng)2 h，用薄層析法監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程直至原料消耗完全。將50 mL碳酸氫鈉溶液加入反應(yīng)體系中，再用二氯甲烷萃取3次。合并有機(jī)相，用柱層析純化即可得到純凈的探針RHO（見圖2）。

圖2 熒光探針RHO的合成路線

(2)核磁共振波譜儀檢測(cè)。稱取8 mg探針粉末溶于5 mL氘代二甲亞砜中，用玻璃滴管轉(zhuǎn)移至干凈的核磁管內(nèi)，用核磁共振波譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

(3)檢測(cè)溶液的制備。探針儲(chǔ)備溶液：稱取5.8 mg探針粉末溶于10 mL N，N-二甲基甲酰胺配制成為10 mmol／mL的探針儲(chǔ)備溶液。

被檢測(cè)物儲(chǔ)備溶液：分別稱取適量的谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸、谷氨酸和組氨酸溶于PBS緩沖溶液中配制成為濃度為10 mmol／mL的被檢測(cè)物儲(chǔ)備溶液。

待測(cè)液配制方法：①空白溶液。將300μL的無(wú)水DMF溶液與2.70 mL的PBS緩沖溶液混合。②探針參比溶液。在270μL的無(wú)水DMF溶液與2.70 mL的PBS緩沖溶液的混合溶液中加入30μL的探針儲(chǔ)備溶液。③實(shí)驗(yàn)組待測(cè)溶液。270μL的無(wú)水DMF溶液與2.64 mL的PBS緩沖溶液的混合溶液中加入30 μL的探針儲(chǔ)備溶液，混合均勻后，分別加入60μL不同種類的被檢測(cè)物儲(chǔ)備溶液。

(4)紫外-可見光譜測(cè)試參數(shù)。使用安捷倫Carry 60紫外-可見吸收光譜儀，1 cm吸收池，選擇吸收波長(zhǎng)為500～650 nm。

(5)熒光光譜測(cè)試參數(shù)。使用安捷倫Cary Elipse熒光分光光度計(jì)，1 cm石英池測(cè)定。激發(fā)波長(zhǎng)為555 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為580 nm，狹縫為5／10 nm，電壓500 V，測(cè)試溫度25℃。

4 結(jié)果與討論

4.1 探針的核磁結(jié)構(gòu)表征

探針RHO的1H表征數(shù)據(jù)：9.94（1 H，s），7.82（1 H，m），7.64～7.41（2 H，m），7.12～6.92（1 H，m），6.58～6.42（2 H，m），6.33（4 H，d，J＝2.1），3.76（2 H，s），3.39～3.30（8 H，m），1.12～1.06（12 H，t，J＝6.9）。如該化合物的1H譜圖3所示，在（1.12～1.06）×10－6范圍內(nèi)出現(xiàn)的三重峰為4個(gè)甲基上的12個(gè)H（Ha）；在3.30～3.39×10－6出現(xiàn)的四重峰可以歸屬為4個(gè)亞甲基的8個(gè)氫（Hb），3.76×10－6處出現(xiàn)的明顯的單峰為溴代酰胺α位置的2個(gè)氫（Hc）；在9.94×10－6的位置能夠觀察到一個(gè)矮寬峰為亞氨基氫的特征峰型（Hd）。除此之外，譜圖6.0～8.0×10－6的范圍中可以觀察到5組氫分別對(duì)應(yīng)了探針芳基上的10個(gè)氫原子（HAr）。

圖3 探針RHO的1 H NMR譜圖

4.2 探針對(duì)谷胱甘肽的檢測(cè)性能

分別將3 mL空白溶液、參比溶液和加入了谷胱甘肽的被檢測(cè)液放入1 cm的石英池中，在紫外分光光度計(jì)的作用下對(duì)500～650 nm范圍的紫外可見吸收進(jìn)行檢測(cè)。如圖4（a）所示，空白溶液及只加入了探針的參比溶液在此范圍內(nèi)均沒有發(fā)現(xiàn)明顯的紫外可見吸收峰；而當(dāng)加入了谷胱甘肽的被檢測(cè)液放入紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行檢測(cè)時(shí)可觀測(cè)到在575 nm處出現(xiàn)了明顯的吸收峰。同樣地，將空白溶液、參比溶液及谷胱甘肽的待測(cè)溶液分別放入熒光分光光度計(jì)下用555 nm的激發(fā)波長(zhǎng)，在565～650 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描可得如圖4（b）所示的結(jié)果：只有在谷胱甘肽加入的情況下才能觀測(cè)到明顯的熒光發(fā)射峰，空白和參比溶液均無(wú)法引起明顯的熒光發(fā)射光譜。

圖4 空白溶液、探針參比溶液及探針RHO與谷胱甘肽作用的光譜圖

4.3 檢測(cè)谷胱甘肽的特異性

為了證明探針RHO對(duì)谷胱甘肽的檢測(cè)性能具有特異選擇性，需要在相同條件下檢測(cè)該探針對(duì)相似結(jié)構(gòu)氨基酸的檢測(cè)性能。因此，配制含有不同種類氨基酸（同型半胱氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸、谷氨酸和組氨酸）的待測(cè)溶液，并在同等檢測(cè)條件下觀測(cè)到的紫外吸收光譜及熒光發(fā)射光譜的變化。如圖5所示，將參比溶液以及加入不同種類氨基酸的待測(cè)溶液在紫外分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)中掃描，可以發(fā)現(xiàn)只有谷胱甘肽加入的情況下可以觀測(cè)到575 nm的吸收峰以及在580 nm處出現(xiàn)的明顯發(fā)射峰，其他種類的氨基酸并未引起明顯的光譜變化，這說明探針RHO對(duì)谷胱甘肽的檢測(cè)能力具有特異選擇性。

圖5 探針RHO與谷胱甘肽和其他氨基酸作用的光譜圖

5 結(jié) 語(yǔ)

本設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了熒光探針分子RHO對(duì)生物活性小分子物種谷胱甘肽的特異性識(shí)別性能。學(xué)生需要完成一步條件溫和、污染性小且難度適中的有機(jī)合成反應(yīng)并借助紫外可見光譜儀、熒光分光光度計(jì)完成探針RHO的性質(zhì)驗(yàn)證。此外，學(xué)生將在教師的輔助下學(xué)習(xí)用核磁共振波譜儀對(duì)有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證，并將通過直接動(dòng)手操作熒光分光光度計(jì)和紫外可見光分光光度計(jì)學(xué)習(xí)光譜特征在化合物性能驗(yàn)證中的重要作用［13-16］。該設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)包含了前沿文獻(xiàn)閱讀、相關(guān)文獻(xiàn)查閱、有機(jī)合成、結(jié)構(gòu)解析及化合物性質(zhì)驗(yàn)證等過程，學(xué)生在設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)的過程中得到了系統(tǒng)且全面的訓(xùn)練，有助于培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)研究興趣以及獨(dú)立思考解決問題的能力。