4種病原菌“單管一步法”PCR快速檢測方法的建立

潘雅君， 徐汪節， 彭麗娜， 喬中東， 王朝霞

（上海交通大學a.實驗動物中心；b.生命科學技術學院，上海 200240）

0 引 言

對實驗動物定期進行微生物檢測是實驗動物質量控制中非常重要的環節［1-3］。肺炎克雷伯桿菌（KlebsiellɑPneumoniɑe，K.pneumoniɑe）、金黃色葡萄球菌（Stɑphylococcusɑureus，S.ɑureus）、嗜肺巴斯德桿菌（Pɑsteurellɑpneumotropicɑ，P.pneumotropicɑ）和綠膿桿菌（Pseudomonɑsɑeruginosɑ，P.ɑeruginosɑ）是SPF級實驗小鼠必須檢測和排除的項目［4］。這4種病原菌均屬于條件性致病菌，在動物免疫功能低下等特定情況下引起感染，對于免疫系統受損的宿主影響較大，常表現為感染、炎癥甚至死亡［5-7］。從近年來國內外實驗動物質量監測結果可以看出，這4種病原菌在實驗小鼠中的感染率較高［8-12］，嚴重影響實驗動物質量，干擾試驗結果。

中國實驗動物微生物學檢測方法（GB14926）針對上述4種細菌推薦的檢測方法主要為分離培養和生化鑒定。但該方法通常需要3～7 d，操作煩瑣，費時費力，也不適用于無法培養的微生物，檢測周期較長，對檢測人員專業技能要求較高［13-16］，不適用于對這4種細菌同時進行簡便、快速檢測。

近年來，分子檢測方法如質譜（MS），聚合酶鏈反應（PCR），環介導等溫擴增（LAMP），高通量下一代測序（NGS）等迅速發展［14，17-18］。PCR方法可以快速準確檢測樣品中的微生物，在此基礎上發展的多重PCR可以使用多對特異性引物同時檢測樣本中的多種病原體，但由于樣本中待檢測病原體的含量較低以及多種引物的干擾，往往導致一些非特異性片段在經過30個PCR循環后出現條帶，影響檢測的準確性［19-20］。

本文設計了一種基于16S rDNA序列的檢測思路，能夠通過一步PCR反應同時檢測多種實驗動物病原體。為避免多重PCR的缺點，將16S rDNA保守區的富集和16SrDNA特異性可變區檢測這兩個步驟整合為一步反應，并選擇了肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜肺巴斯德桿菌和綠膿桿菌進行檢測驗證。結果表明多重巢式PCR（MN-PCR）方法靈敏度更高，在臨床樣本檢測中比多重PCR更加簡便，節省了時間和勞力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

(1)菌株。金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、肺炎克雷伯桿菌（ATCC 46117）、表皮葡萄球菌（ATCC 12228）購自廣東省微生物菌種保藏中心。綠膿桿菌、嗜肺巴斯德桿菌由本實驗室分離保存。多殺巴斯德桿菌（ATCC 12945）基因組DNA、肺炎鏈球菌（ATCC 49619）、鼠傷寒沙門氏菌（SL1344）、大腸桿菌（CMCC 44102）由中國農業科學院上海獸醫研究所惠贈。

(2)實驗動物臨床檢測樣本。選取了4個經第三方檢測機構檢測結果分別為肺炎克雷伯桿菌陽性，金黃色葡萄球菌陽性，嗜肺巴斯德桿菌陽性，綠膿桿菌陽性的小鼠咽拭子樣本。同時選取了39只不確定是否有細菌感染的待生物凈化小鼠，飼養在隔離包中，采集咽拭子樣本。

(3)引物。本研究中設計了一對通用引物：Universal Primers-F，Universal Primers-R（UP-F，UPR）和4對特異引物：K.pneumoniɑe-F，K.pneumoniɑe-R（KP-F，KP-R），S.ɑureus-F，S.ɑureus-R（SA-F，SA-R），P.pneumotropicɑ-F，P.pneumotropicɑ-R（PPF，PP-R），P.ɑeruginosɑ-F，P.ɑeruginosɑ-R（PA-F，PA-R）（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列

(4)主要試劑。羊血瓊脂平皿購自上海伊華醫學科技有限公司；營養肉湯培養基購自杭州濱河微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA快速提取試劑盒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒和PCR純化試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；100 bp DNA Ladder購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；2×ES Taq Master Mix（Dye）購自北京康為世紀生物科技有限公司；瓊脂糖和SYBR safe核酸染料購自英濰捷基（上海）貿易有限公司。

1.2 實驗方法

(1)細菌基因組DNA提取。將所有菌株分別劃線接種于血瓊脂平皿，37℃培養24 h后挑取單菌落，接種于5 mL液體營養肉湯培養基，37℃有氧條件下振蕩培養18～24 h，取1 mL菌液，嚴格按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作，提取DNA模板于－20℃用于后續PCR檢測。通過細菌基因組DNA快速分離試劑盒提取模板DNA。

(2)實驗動物咽拭子樣本處理。采集小鼠的咽拭子樣本并將其浸入1.5 mL無菌水中10 min，對咽拭子進行吹打懸浮后分為兩部分進行處理：將其中750μL接種培養按照1.2.（1）步驟提取基因組DNA；將剩余750μL在8 000 r／min下離心2 min，除去上清，加入15μL TE（Tris＋EDTA）緩沖液并充分混合作為PCR模板。

(3)MN-PCR方法特異性檢測。反應體系為20 μL，包括：2×ES Taq Master Mix（Dye）10μL；引物UP-F，UP-R各0.01μmol／L；特異性引物（KP-F，KPR，SA-F，SA-R，PP-F，PP-R，PA-F和PA-R）各0.15 μmol／L；模板DNA各1 ng。

鹿科屬于偶蹄目，大多數雄鹿都長有角，這是雄性的象征。生活在北方的鹿，鹿角會在繁殖季節過后脫落，第二年再生出新的角。初長的角叫作“茸”，外面包裹著皮膚，角上有一層細細的絨毛，還有血管為新生的角大量供血。隨著鹿角慢慢長大，供血會逐漸停止，鹿角隨之干枯脫落。1—2歲小鹿的角是直直的，鹿角的分叉會隨著它們年齡的增長而增多，直到成年才會定型。

反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行15個循環；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行25個循環；最后72℃延伸10 min。

PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

(4)MN-PCR方法在4種病原體檢測中的靈敏度。MN-PCR反應體系為20μL，模板DNA在體系中的終含量分別為：1 pg，100 fg，10 fg，1 fg，10－1fg，10－2fg，10－3fg，10－4fg，體系中其他參數同1.2.（3）中所述。反應條件同1.2.（3）中所述。

普通多重PCR反應體系為20μL，包括：2×ES Taq Master Mix（Dye）10μL，特異性引物（KP-F，KPR，SA-F，SA-R，PP-F，PP-R，PA-F和PA-R）各0.15 μmol／L，模板DNA終濃度同上。反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行30個循環；72℃延伸10 min。

PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

2 結 果

2.1 MN-PCR方法在4種病原體檢測中的特異性

以實驗動物微生物檢測中的一些常見細菌和相近菌株作為陰性對照來驗證MN-PCR方法檢測的特異性，包括：肺炎鏈球菌，表皮葡萄球菌，多殺巴斯德桿菌，鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌。結果表明，設計的4種特異性引物均能準確擴增出預期的目的條帶，而無法以對照細菌基因組DNA為模板擴增出其他DNA條帶，有較好的特異性（見圖1）。

2.2 普通多重PCR與MN-PCR方法檢測單模板靈敏度比較

對MN-PCR和普通多重PCR方法的靈敏度進行比較。結果表明，在檢測單種細菌時2種方法的靈敏度有很大的差異，MN-PCR的靈敏度比普通多重PCR方法高10～100倍（見圖2）。

圖1 MN-PCR檢測方法的特異性

圖2 MN-PCR和普通多重PCR方法在單模板檢測中的靈敏度比較

2.3 MN-PCR方法對4種病原體的多重檢測能力

根據MN-PCR優化條件，將4種待測細菌的基因組DNA按照：單細菌基因組，兩兩細菌混合基因組，三三細菌組合基因組以及四種細菌基因組，分別作為MN-PCR模板，驗證了該方法的多重檢測能力。結果表明，單一模板和多種模板的PCR產物條帶均清晰可辨（見圖3）。

圖3 通過MN-PCR檢測四種細菌

2.4 MN-PCR方法同時檢測4種病原體的靈敏度

驗證了MN-PCR方法和多重PCR方法在同時檢測4種病原體時的靈敏度。結果表明，利用MN-PCR方法可以同時檢測出4種細菌的特異性條帶，靈敏度為10 fg，而多重PCR無法同時檢測出4種細菌（見圖4）。

圖4 MN-PCR和多重PCR方法在多種混合模板檢測中的靈敏度比較

2.5 MN-PCR方法在臨床樣本檢測中的應用

為了評估該方法在實際樣本檢測過程中的應用效果，選擇了部分確定陽性的臨床樣本，以及未知待檢39臨床樣本（樣品來源于39只待生物凈化小鼠），分別利用MN-PCR和多重PCR方法進行了檢測，已確定陽性樣本檢測結果如圖5所示，與已知確認陽性一致。同時，為了驗證在某些極端情況下如SPF小鼠同時感染多種細菌時，MN-PCR方法是否能夠同時檢測臨床樣本中多種微生物，混合臨床樣本進行MN-PCR方法檢測。結果顯示，MN-PCR方法能夠同時擴增出2種細菌的目的條帶（圖5（a）～（d）），而傳統的多重PCR在以未經培養的低模板濃度下無法擴增出目的條帶（圖5（e））。

圖5 利用MN-PCR方法對臨床樣本進行檢測

未知待檢的39份臨床樣本檢測結果如表2所示，MN-PCR在對未經培養的臨床樣本進行檢測時檢出率高于普通PCR方法，且與培養后PCR驗證結果相同。

3 討 論

微生物檢測在非常多的領域都發揮著重要的作用。傳統的檢測方法如對樣本進行培養，對可疑菌落進行分離純化和生化鑒定的操作費時費力，難以應用于常規的大規模檢測。近年來，微生物檢測的方法也在不斷創新，PCR技術的不斷進步推動其在微生物檢測中的應用越來越廣。

表2 不同方法對39份臨床樣本中4種病原菌的檢出率

多重PCR可以同時擴增多個DNA片段，通常用于檢測樣本中的多種微生物，可以節省大量時間和精力，已被成功應用于許多領域的微生物檢測中。但普通多重PCR很容易出現特異性和多重性檢測的矛盾。

為了克服普通多重PCR方法上述不足，在MNPCR方法中整合巢式PCR和多重PCR的優點，來確保擴增檢測的高靈敏度和特異性。以肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜肺巴斯德桿菌和綠膿桿菌4種實驗動物設施常見細菌為例，在其16srDNA保守區內設計了一對通用引物并使用簡并堿基來避免差異位點的擴增偏好，在首輪PCR中擴增富集待測細菌的16srDNA全長序列，后續基于每種細菌16srDNA序列的可變區設計特異性檢測引物以擴增不同片段長度的檢測產物（見圖6）。同時，為了將16srDNA序列保守區域的富集和特異區域的擴增整合為一步PCR，實現快速、靈敏，同時檢測多種微生物，采用如下設計策略：利用通用引物及特異性引物長度差異達到兩階段PCR退火溫度高低不同；控制通用引物及特異性引物濃度的高低，使得低濃度通用引物既可以發揮作用且產物（1 500 bp片段）在電泳凝膠中不顯示條帶，從而在富集16srDNA序列片段的同時不會干擾第2階段的特異性擴增；此外，對兩個PCR階段的循環數進行了優化來確定最終的反應條件及體系。

圖6 MN-PCR整體效果示意圖

在實際臨床樣本的檢測中，糞便或咽拭子樣本中微生物種類非常復雜，包含細菌、病毒和其他物質等。由于樣品中待檢測細菌含量低和存在雜質的影響，通常很難直接作為PCR檢測的模板。普通多重PCR方法通常需要較高的模板濃度，在檢測前需要對微生物進行培養富集，這是一個費時費力的過程，并且會增加污染的可能性從而導致潛在的假陽性。而MN-PCR方法由于具有較高的靈敏度，無需培養富集即可直接對樣本中的微量細菌進行檢測。與培養后的臨床樣本檢測結果相比，MN-PCR方法具有較好的準確性，大大縮短檢測時間和成本，減少了工作量，做到快速準確。因此，NM-PCR方法可以快速大量檢測臨床樣本，在環境水源、臨床診斷、食品等領域的微生物檢測中具有非常廣泛的應用前景。

實踐告訴我們，偉大事業都成于實干。新時代是奮斗者的時代。新時代是在奮斗中成就偉業、造就人才的時代。我們要激勵更多科學大家、領軍人才、青年才俊和創新團隊勇立潮頭、銳意進取，以實干創造新業績，在推進偉大事業中實現人生價值，不斷為實現中華民族偉大復興的中國夢奠定更為堅實的基礎、作出新的更大的貢獻。

——2019年2月20日，習近平在會見探月工程嫦娥四號任務參研參試人員代表時講話