偽狂犬病毒HuB2020株的分離與鑒定

翟 瑤，周丹娜，梁 婉，楊克禮，袁芳艷，郭 銳，李 鵬，田永祥

（1.長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025；2.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所/農業農村部畜禽細菌病防治制劑創制重點實驗室，武漢 430064）

偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病毒引起的一種急性傳染病，主要表現為發熱、呼吸道癥狀和神經癥狀等［1］。偽狂犬病毒能感染多種家畜及野生動物，而豬是偽狂犬病毒的自然宿主，且其最為易感，發病情況也最為嚴重［2］。偽狂犬病毒（Pseudo?rabies virus，PRV）可以引起種豬繁殖障礙，新生仔豬神經癥狀及急性死亡、生長豬及育肥豬出現呼吸道癥狀等［3-5］。其臨床癥狀取決于感染豬的日齡、感染途徑、感染毒株的毒力及自身免疫情況等［6］。目前，豬偽狂犬病在全球范圍內廣泛流行，給世界養豬業造成嚴重的經濟損失。因此，很多國家采取了PRV凈化策略，歐洲的多數國家及加拿大、美國和新西蘭等已經根除了該病毒［7，8］。隨著規模化養殖場的增多，2011年中國PRV出現了許多的變異毒株［9］，導致養殖場即使免疫了Bartha-K61疫苗也無法達到免疫效果。本研究從臨床病料中分離純化出1株豬偽狂犬病毒——HuB2020，并對其毒力、培養特性及遺傳變異進行了系列研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 從湖北某豬場采集疑似病料，取組織樣品于-20℃保存備用。

1.1.2 主要試劑 AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒。胰酶、青鏈霉素雙抗和胎牛血清均購自Gibco公司，DMEM培養基購自HyClone公司，DL 2000 DNA Marker、DL 5000 DNA Marker以及高保真酶PrimeSTAR購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 細胞及試驗動物 所用細胞為豬腎傳代細胞（PK15），試驗動物為6周齡昆明小鼠。

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA的提取及PCR檢測 將采集的組織病料加適量PBS溶液，勻漿破碎后反復凍融3次，離心取上清。按照AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒說明書提取DNA。采用偽狂犬gD基因和gE基因外檢引物分別用于檢測偽狂犬病疫苗毒和野毒。

1.2.2 病毒的分離 以細胞培養瓶進行傳代培養，取出細胞培養瓶，棄培養基，用PBS溶液洗細胞2次，加入2 mL DMEM培養基（不含血清）、加入病毒液于37℃中孵育2 h，補足至DMEM（含2%FBS和1%青鏈霉素雙抗）6 mL，同時設置對照組。待80%左右的細胞出現病變并脫落時收取病毒液，于-80℃反復凍融3次后繼續傳代。將收取的病毒進行純化，并使其在PK15細胞穩定傳代。

1.2.3gE基因序列遺傳進化分析 用Primer Pre?mier 5設計gE基因長片段引物，PCR擴增獲得gE基因，經過測序獲取基因序列。通過軟件DNAStar分析該病毒基因序列與NCBI上已公布的PRVgE基因序列（表1）的同源性，利用MEGA-X構建系統進化樹，對基因序列遺傳進化進行分析。

1.2.4 PRV HuB2020株的病毒滴度測定 從培養箱中取出已鋪好的96孔板，將純化后的病毒液按10倍梯度稀釋，取10-1～10-88個稀釋梯度接種于96孔板，每個稀釋度8孔，每孔接種100μL，并設置陰性對照，對照孔每孔加入100μL DMEM。將96孔板置于37℃恒溫培養箱，每天記錄觀察，按照Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

1.2.5 PRV HuB2020株在PK15細胞中的一步生長曲線 取細胞培養瓶，棄培養基，用PBS溶液清洗細胞2次，加入1 mL含100 TCID50的病毒液，于37℃CO2培養箱孵育2 h。然后換成2%FBSDMEM培養基，每隔12 h（12、24、36、48、60、72、84、96 h）吸取細胞上清液300μL，并補充同等體積的2%FBSDMEM培養基，測定8個時間節點病毒液的TCID50，并繪制生長曲線。

表1 PRV參考毒株信息

1.2.6 動物實驗 6周齡昆明小鼠100只，分為5組，每組20只。分別以103.0、104.0、105.0、106.0TCID50/0.1 mL的滴度分別接種4組小鼠，接種劑量為0.1 mL，接種途徑為背部皮下注射，同時以20只小鼠注射同樣劑量的DMEM培養液作為陰性對照。接種后觀察小鼠臨床癥狀及死亡情況，按照Reed-Muench法分別計算病毒的半數致死量LD50，并以PCR方法檢測病毒在各組織的分布情況。每只小鼠分別取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟以及腦組織，破碎后取上清，按照AxyPrep的DNA/RNA提取試劑盒說明書提取組織DNA，以提取的組織DNA為模板進行PCR擴增，結果用GraphPad Prism5進行分析。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測結果

提取組織病料基因組DNA，用偽狂犬外檢引物進行檢測。對分離出的病毒進行PRVgD基因和gE基因短片段的PCR擴增，結果（圖1）表明，擴增出217 bp和368 bp的特異性目的條帶，與預期大小相符。

圖1 PRV gD/gE基因PCR檢測結果

2.2 病毒分離結果

將收集的病毒液在PK15細胞上進行傳代培養，細胞在接毒24 h后有明顯的細胞病變，細胞變大變圓，呈空泡狀（圖2）。

圖2 HuB2020株感染PK 15的病變觀察（100×）

2.3 病毒生長動力學結果

HuB2020株在PK15細胞上的一步生長曲線結果如圖3所示。由圖3可以看出，HuB2020株在36 h達到最高值106.5TCID50/0.1 mL，即107.5TCID50/mL，然后病毒滴度逐漸降低（圖3）。

圖3 HuB2020株在PK 15細胞上的一步生長曲線

2.4 gE基因遺傳進化分析結果

提取病毒基因組DNA擴增gE基因長片段結果如圖4所示。由圖4可以看出，成功擴增出2 281 bp的特異性目的條帶，并與NCBI上已發表的序列進行遺傳進化分析，HuB2020株gE基因核苷酸序列與國外報道的PRV毒株的核苷酸序列同源性為97.6%～99.3%，與國內報道的PRV毒株的核苷酸序列同源性為98.9%～99.9%；HuB2020株gE基因編碼的氨基酸序列與國內流行變異株同源性為98.9%～99.9%，與 國 內 經 典 株Ea、Fa、TJ、HeN1等 的 同 源 性 為99.6%～99.8%，與國外經典株Becker、Kaplan株等同源性為97.6%～97.9%。同時，基于gE基因的系統進化樹分析發現，PRV-HuB2020株與國內分離株屬于相同分支，親緣關系較近，與國外PRV經典毒株Becker不屬于同一進化樹分支，親緣關系較遠（圖5）。

圖4 gE基因長片段擴增

2.5 動物試驗結果

結果表明，106.0、105.0TCID50/0.1 mL攻毒組對小鼠的致死率為100%。感染HuB2020株的昆明小鼠半數致死量（LD50）為1×105.7。小鼠存活數量隨著稀釋度升高而增多（圖6）。PCR檢測組織嗜性分布結果顯示，106.0、105.0TCID50/0.1 mL攻毒組對小鼠的神經嗜性高達100%，且病毒在腦組織和心臟組織中的檢出率均顯著高于其他組織（圖7）。

圖5 HuB2020株gE基因核苷酸系統進化樹

圖6 小鼠攻毒后存活情況

圖7 小鼠組織感染情況

3 小結與討論

偽狂犬病是在世界范圍內廣泛流行的一種動物傳染病，而且動物一旦感染，可終身帶毒、難以根除。隨著規模化養殖場的增多，即使免疫了傳統偽狂犬疫苗也無法提供完全保護，甚至出現了許多的偽狂犬變異毒株。而目前對于該病的防控仍以疫苗免疫預防為主［10］。豬是偽狂犬病毒的主要宿主和惟一自然儲存宿主，感染該病毒的豬因日齡不同表現出不同的癥狀，新生仔豬感染后出現神經癥狀及急性死亡，死亡率高達100%，生長豬以及育肥豬在感染后出現呼吸道癥狀等。目前，使用疫苗免疫仍然有流行變異株的出現，使偽狂犬病毒在宿主體內適應后發生基因突變，這些適應性的突變也正是偽狂犬病毒實現跨宿主傳播而感染人。有研究報道偽狂犬病毒感染人的病例，但未能分離出病毒，Liu等［11］首次從人腦脊髓液中分離出偽狂犬病毒，該毒株與中國偽狂犬病毒流行變異株有著相似的生物學特性，這也進一步表明偽狂犬病毒的可跨種傳播性，使偽狂犬病毒的防控已經不再局限于動物，還有養殖行業的工作人員以及研究人員。目前在中國廣泛使用的疫苗有Bartha-K61、HB98、Ea株等，在偽狂犬病的臨床上有一定的防治作用，但對阻止病毒變異和傳播方面尚未有較好的效果。

本研究以PK15細胞從湖北省某豬場的疑似病料中分離出一株偽狂犬病毒。該病毒在PK15細胞上可以穩定地增殖和傳代，并表現出明顯的偽狂犬病毒的細胞病變，感染病毒的細胞出現空泡，變大變圓；病毒純化后測定該病毒最高滴度為107.5TCID50/mL。gE基因長片段的遺傳進化分析結果表明，該毒株與2011年以來國內流行變異株同屬于一個分支，遺傳關系較近。小鼠攻毒試驗結果顯示，PRV-HuB2020株對小鼠毒力較強，對小鼠的半數致死量LD50為1×105.7，相較于Rui等［12］以SC株傳統強毒株的小鼠試驗的毒力更強。組織PCR檢測組織嗜性分布結果顯示，該毒株對小鼠具有極強的神經嗜性，且病毒在心臟組織中的檢出率也顯著高于其他組織，而這種對于心臟組織的嗜性在PRV的研究中鮮有報道。

該分離株為偽狂犬流行變異株且與國內流行株同源關系較近，在PK15上增殖穩定且對小鼠有高致死率，具有顯著的神經嗜性及心臟組織嗜性。目前對于PR的防控主要以免疫疫苗為主，PRV仍在處于不斷變異的過程，對于養殖行業來說依舊有著潛在的風險。