‘遼峰’葡萄葉片不定芽再生研究

劉淑芳

（遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 營口115009）

葡萄（Vitis vinifera L.）遺傳背景比較復(fù)雜，育種周期較長，常規(guī)的育種方法在葡萄品種改良上受到明顯的限制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，將目的基因轉(zhuǎn)入葡萄植株體內(nèi)，可改良某些性狀，從而提高育種效率，這為改良葡萄品種開辟了一條新的路徑[1]，建立一個(gè)高效穩(wěn)定的葉盤再生受體系統(tǒng)在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法中顯得非常重要。為此，我們探討了不同生長調(diào)節(jié)劑組合、培養(yǎng)基和暗培養(yǎng)對(duì)‘遼峰’葡萄葉片不定芽再生的影響，以期為建立一個(gè)高效、穩(wěn)定的再生系統(tǒng)和基因轉(zhuǎn)化體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以葡萄品種‘遼峰’為試材。試驗(yàn)在遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)園藝系組培實(shí)訓(xùn)室進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)間為2018年3月至2020年12月。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同生長調(diào)節(jié)劑組合的篩選 按L16（44）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1、表2），以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L及水解酪蛋白（CH）0.25 g/L，pH 5.8。從苗齡35 d左右的‘遼峰’葡萄組培苗上剪取頂部平展幼嫩的葉片，橫剪為0.5～1.0 cm2大小葉塊，以葉背接觸培養(yǎng)基。每個(gè)處理接種20個(gè)葉塊，重復(fù)3次，接種后培養(yǎng)皿用‘Parafilm’密封。

1.2.2 基本培養(yǎng)基對(duì)‘遼峰’葉片不定芽再生的影響分別以1/2 MS、MS、WPM、NN69為基本培養(yǎng)基，附加篩選出的最佳生長調(diào)節(jié)劑組合，按前述方法接種‘遼峰’葡萄葉片。

1.2.3 暗培養(yǎng)對(duì)‘遼峰’葉片不定芽再生的影響 將葉片接種在篩選出的最佳生長調(diào)節(jié)劑組合和最佳基本培養(yǎng)基上，分別進(jìn)行0、7 d、14 d和21 d的暗培養(yǎng)處理后，置于光下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.4 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照度2 400～3 000 lx，光照周期16 h/8 h。

1.2.5 試驗(yàn)結(jié)果觀察與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 在培養(yǎng)過程中，定期觀察葉片變化和不定芽發(fā)生情況。培養(yǎng)至50 d時(shí)，統(tǒng)計(jì)不定芽再生率和平均每葉芽數(shù)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長調(diào)節(jié)劑組合對(duì)‘遼峰’葉片不定芽再生的影響

‘遼峰’葉片接種在BA-Auxin組合上的試驗(yàn)結(jié)果見表1，培養(yǎng)7 d后就可觀察到3#、4#、6#～8#、14#～16#處理上出現(xiàn)少量白色愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，愈傷組織逐漸增多，培養(yǎng)21d后，7#、8#、14#處理上的愈傷組織呈黃白色，個(gè)別葉塊傷口處出現(xiàn)黃綠色的芽點(diǎn)，15#、16#處理上的愈傷組織轉(zhuǎn)為綠白色、半透明緊密狀，其他處理上的愈傷組織開始變褐死亡。 此后，僅有3#、4#、7#、8#、14#處理上有極少量不定芽伸長形成不定梢，1#～14#處理間不定芽再生率差異不顯著。

表1 ‘遼峰’離體葉片不定芽再生試驗(yàn)方案L16（44）與結(jié)果統(tǒng)計(jì)（BA濃度）

‘遼峰’葉片接種在TDZ-Auxin組合上時(shí)（表2），愈傷組織和不定芽的發(fā)生情況普遍優(yōu)于BA-Auxin組合上，且發(fā)生量也明顯增多。培養(yǎng)20多天后，17#、21#、22#、25#、27#～29#、32#處理上的愈傷組織或葉片相繼褐化死亡。其余處理培養(yǎng)21 d后葉片傷口或愈傷組織上開始出現(xiàn)密集的綠色小芽點(diǎn)，接種20～35 d為不定芽發(fā)生高峰期，隨后芽點(diǎn)逐漸增大發(fā)育為不定芽，50 d后不定芽數(shù)不再增加，只是原有的不定芽伸長為不定梢，20#處理上不定芽再生率高達(dá)65.68%，極顯著高于其他處理。

表2 ‘遼峰’離體葉片不定芽再生試驗(yàn)方案L18（44）與結(jié)果統(tǒng)計(jì)（TDZ濃度）

2.2 基本培養(yǎng)基對(duì)‘遼峰’葉片不定芽再生的影響

1/2MS、MS、WPM、NN69 4種基本培養(yǎng)基附加篩選出的最佳生長調(diào)節(jié)劑組合NAA 1.2 mg/L+TDZ 3.0 mg/L對(duì)葉片不定芽再生影響結(jié)果見表3。1/2 MS作為基本培養(yǎng)基效果最好，不僅愈傷組織極少，而且不定芽再生率和平均每葉再生芽數(shù)都較高，與其他處理差異極顯著。MS培養(yǎng)基上愈傷組織也較少，但不定芽再生率低于1/2 MS，與賈曉平[2]的研究一致，這可能是由于MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽含量較高，促進(jìn)了愈傷組織的形成。‘遼峰’葉片在WPM上不定芽再生能力較差，只產(chǎn)生少數(shù)幾個(gè)不定芽，而在NN69上無不定芽發(fā)生。

表3 基本培養(yǎng)基對(duì)‘遼峰’葉片不定芽再生的影響

2.3 暗培養(yǎng)對(duì)‘遼峰’葉片不定芽誘導(dǎo)的影響

‘遼峰’葉塊接種于最佳培養(yǎng)基1/2MS+NAA 1.2 mg/L+TDZ3.0 mg/L上，分別進(jìn)行0、7 d、14 d、21 d的暗培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)入光下常規(guī)培養(yǎng)。結(jié)果表明（表4），暗培養(yǎng)可促進(jìn)‘遼峰’葡萄葉片不定芽的再生，各處理間存在極顯著差異。暗培養(yǎng)14 d的不定芽再生率最高，達(dá)87.10%，隨著暗培養(yǎng)時(shí)間加長，不定芽再生率呈下降趨勢。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)平均每葉塊再生芽數(shù)的影響差異不顯著。

表4 暗培養(yǎng)對(duì)‘遼峰’葉片不定芽再生的影響

3 結(jié)論與討論

在植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加一定濃度的生長調(diào)節(jié)劑可以調(diào)整外植體的激素水平，因此尋求適宜的生長調(diào)節(jié)劑組合尤其重要。本研究結(jié)果表明，不同生長調(diào)節(jié)劑組合、基本培養(yǎng)基和暗培養(yǎng)對(duì)‘遼峰’葡萄葉片不定芽再生均有顯著作用。將‘遼峰’葉片接種在1/2 MS+NAA 1.2 mg/L+TDZ 3.0 mg/L上，先暗培養(yǎng)14 d，后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，對(duì)‘遼峰’葉片不定芽再生效果最好，不定芽再生率高達(dá)87.10%，且不定芽生長健壯。

陳力耕等[3]以‘玫瑰香’葡萄莖段為外植體建立起高頻器官再生體系，并進(jìn)行了基因的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)基因植株；陶建敏等[4]研究了不同激素組合對(duì)‘美人指’葡萄葉片、葉柄和莖段不定芽發(fā)生的影響，結(jié)果表明，莖段不定芽再生頻率最高，達(dá)到75%。目前，葡萄再生體系的報(bào)道較多，但只有少數(shù)品種再生率較高[5-6]，且未見‘遼峰’葡萄葉片不定芽再生的報(bào)道。由于不同基因型葉片不定芽誘導(dǎo)率差異較大，不同外植體類型再生效果也不同，同一葉片不同部位誘導(dǎo)率也各異，因此，在進(jìn)行葡萄再生體系的研究中，除了研究基本培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑組合、添加物和培養(yǎng)條件外，也要進(jìn)行葡萄器官發(fā)生機(jī)理研究，以便從根本上解決葡萄葉片再生較難、再生率低等問題。