柑橘黃龍病菌在柑橘病樹(shù)不同部位中的定量分布情況研究

馮賢巧

（陽(yáng)江市植保植檢和種子土肥環(huán)保管理站 廣東陽(yáng)江529500）

柑橘黃龍病是全球柑橘產(chǎn)業(yè)中威脅最大的柑橘病害[1]。我國(guó)是柑橘主產(chǎn)國(guó)，但有9個(gè)柑橘主產(chǎn)省受到該病的危害，其中，廣東省有24萬(wàn)hm2橘園，目前有1/3以上感染該病，年損失達(dá)上百億元[2-3]。

柑橘黃龍病的病原物為韌皮部桿菌屬細(xì)菌，柑橘植株被侵染后，植株生長(zhǎng)緩慢，發(fā)病葉片常表現(xiàn)為均勻或斑駁黃化，而發(fā)病果實(shí)變小或畸形，常出現(xiàn)“紅鼻子果”或果皮青綠等癥狀，果實(shí)品質(zhì)大大降低。柑橘感病后在3～5年內(nèi)死亡或喪失結(jié)果能力[4]。

不同的柑橘品種對(duì)黃龍病菌的感病性不同，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)廣東省陽(yáng)春市馬水鎮(zhèn)4個(gè)柑橘品種多個(gè)部位上采集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，定量分析了柑橘黃龍病菌在柑橘病樹(shù)中的分布情況，以期為黃龍病的檢測(cè)和綜合防控提供參考依據(jù)。

1 材料方法

1.1 樣品采集

2019年9～12 月在馬水鎮(zhèn)采集病樣。選擇已感染柑橘黃龍病菌的4種柑橘品種馬水橘、砂糖橘、貢柑和蜜柚進(jìn)行采樣。每個(gè)品種隨機(jī)選擇3棵獨(dú)立的植株進(jìn)行采樣，分別收集新葉、成熟葉及果實(shí)的果皮、橘絡(luò)、囊壁、中心柱等部位。

1.2 植物DNA的提取及柑橘黃龍病菌的檢測(cè)

用去離子水將柑橘組織沖洗干凈，稱(chēng)取200 mg柑橘組織。采用植物DNA提取試劑盒提取植物總DNA。提取的DNA樣品取1μL用核酸定量?jī)x測(cè)定濃度，其余樣品保存于-20℃條件下。檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，引物與探針參照Li等[5]設(shè)計(jì)的引物HL-Bas/HLBr和探針HLBr，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。

1.3 柑橘黃龍病菌靶標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參照李智鵬等人的方法[6]，將含有柑橘黃龍病菌靶標(biāo)基因的陽(yáng)性質(zhì)粒10倍液稀釋成9個(gè)濃度梯度，使用實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x器進(jìn)行PCR檢測(cè)，每個(gè)濃度梯度做3個(gè)技術(shù)性重復(fù)，并獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的線性回歸方程為：

y=-3.369 lg（x）+15.738， 式中，y為Ct值，x為DNA濃度，單位為ng/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘黃龍病菌在不同柑橘品種不同葉片部位中的含量

4個(gè)柑橘品種分別隨機(jī)選擇3棵有黃龍病發(fā)病癥狀的病樹(shù)采集樣品，樣品使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，這些樣品中的黃龍病菌含量在234.02～12 868 503.64拷貝/每克植物組織之間，平均含量約為1 641 452.32拷貝/每克植物組織（表1）。

每個(gè)柑橘樹(shù)分別收集新葉葉脈、新葉葉肉、成熟葉葉脈和成熟葉葉肉樣品，4個(gè)品種收集的4類(lèi)樣品中的柑橘黃龍病菌靶標(biāo)基因平均含量順序?yàn)槌墒烊~葉脈＞成熟葉葉肉＞新葉葉脈＞新葉葉肉（表1）。

成熟葉葉脈樣品和成熟葉葉肉樣品中的黃龍病菌靶標(biāo)基因含量均顯著高于新葉葉脈樣品和新葉葉肉樣品，但成熟葉葉脈樣品和成熟葉葉肉樣品中的黃龍病菌靶標(biāo)含量差異不顯著，新葉葉脈樣品和新葉葉肉樣品中的黃龍病菌靶標(biāo)基因含量差異也不顯著。

表1 柑橘黃龍病菌在不同柑橘品種不同葉片部位中的靶標(biāo)基因含量

2.2 不同柑橘品種果實(shí)不同部位樣品中的靶標(biāo)基因含量

4個(gè)柑橘品種的果實(shí)分別采集囊壁、橘絡(luò)、果實(shí)中柱、果皮和種皮5個(gè)不同部位的樣品，囊壁樣品中的黃龍病菌靶標(biāo)基因平均含量約為147 735.98拷貝/每克植物組織，橘絡(luò)樣品中的黃龍病菌靶標(biāo)基因平均含量約為92 038.65拷貝/每克植物組織，果實(shí)中柱樣品中的黃龍病菌靶標(biāo)基因平均含量約為35 599.74拷貝/每克植物組織，果皮樣品中的黃龍病菌靶標(biāo)基因平均含量約為4 316.67拷貝/每克植物組織，種皮樣品中的黃龍病菌靶標(biāo)基因平均含量約為91 525.49拷貝/每克植物組織（表2）。

從4個(gè)品種收集的5類(lèi)樣品中的柑橘黃龍病菌靶標(biāo)基因平均含量順序?yàn)槟冶跇悠罚鹃俳j(luò)樣品＞種皮樣品＞果實(shí)中柱樣品＞果皮樣品，囊壁、橘絡(luò)樣品中的柑橘黃龍病菌靶標(biāo)基因含量與果皮樣品中的靶標(biāo)基因含量之間有顯著差異，而其他樣品間無(wú)顯著差異。

3 討論

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)廣東省陽(yáng)春市馬水鎮(zhèn)4個(gè)柑橘品種9個(gè)部位中采集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，柑橘黃龍病菌廣泛分布于柑橘的多個(gè)部位，但在不同的柑橘個(gè)體及不同部位樣品中，黃龍病菌的分布很不均勻。

表2 不同柑橘品種果實(shí)不同部位樣品中的靶標(biāo)基因含量

本研究對(duì)馬水鎮(zhèn)4個(gè)柑橘品種葉片樣品的分析表明，成熟葉的葉脈樣品和葉肉樣品中的黃龍病菌靶標(biāo)基因含量均顯著高于新葉的葉脈和葉肉樣品，與前人的研究一致[7-9]。但是，肖翠等人的研究表明，病樹(shù)成熟葉片中的黃龍病菌含量顯著高于新葉葉片中的黃龍病菌含量[10]，本研究數(shù)據(jù)表明，病樹(shù)成熟葉片中的黃龍病菌含量高于新葉葉片中的黃龍病菌含量，但并不顯著，可能與實(shí)驗(yàn)的采樣方法有關(guān)。

褚麗萍等人研究表明，砂糖橘果實(shí)中的柑橘黃龍病菌靶標(biāo)基因平均含量順序?yàn)殚俳j(luò)樣品＞果皮樣品＞中柱樣品＞囊壁樣品[11]，而本研究在馬水鎮(zhèn)4個(gè)柑橘品種果實(shí)上采集的5類(lèi)樣品中的柑橘黃龍病菌靶標(biāo)基因平均含量順序?yàn)槟冶跇悠罚鹃俳j(luò)樣品＞種皮樣品＞果實(shí)中柱樣品＞果皮樣品，存在部分不一致之處，可能與品種及采樣方法有關(guān)。