5406放線菌對西瓜的促生作用及對西瓜枯萎病的防控

孫于淼， 吳慧玲， 張濤濤， 董 丹， 白慶榮

(1.吉林農業大學植物保護學院， 長春 130118； 2.北京市農林科學院植物保護環境保護研究所， 北京 100097)

西瓜是驅熱解暑的常備水果，在夏日很受人們的喜愛。因此，西瓜的產量和品質問題越來越受到重視，目前西瓜生產上主要存在的病害有：枯萎病、蔓枯病、細菌性果斑病等[1]，使西瓜產量和品質下降，嚴重危害了瓜農的收益。

西瓜枯萎病由尖孢鐮刀菌西瓜專化型(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)侵染引起，俗稱“死秧病”，各生長期均可侵染，是一種常見的土傳和種傳病害，典型癥狀是萎蔫[2]。主要防治方法包括嫁接，選育抗病品種，施用化學藥劑，生防菌劑等[3]。農業上常通過噴霧、灌施等方法施用化學農藥來防治西瓜枯萎病，雖見效快、適用性廣，但易形成農藥殘留，并使病原菌產生抗藥性[4]，同時，也會殺滅土壤中的有益菌。因此，亟須生產高效低危害的生防菌劑，目前應用最廣泛的有細菌和放線菌，真菌的木霉屬[5]和非致病性鐮刀菌[6]皆可用來防治枯萎病。

放線菌中的鏈霉菌能產生多種植物激素促進植物生長[7-8]，還能通過提高植物凈光合率、蒸騰速率、氣孔導度等來提高植物光合生理[9-10]。菌株Streptomyces.ahygroscopicusn. var. gongzhulingensis具有廣譜抑菌活性，對水稻稻瘟病病原菌等16種植物病原菌均有抑制效果[11]。

細黃鏈霉菌5406(Streptomycesmicroflavus)又稱涇陽鏈霉菌，尹莘耘[12]首次研發出5406抗生菌肥，并通過試驗證明其對黃瓜、辣椒、西紅柿等作物均具有增產效果[13]，1986年發現5406可產生玉米素、激動素等有效活性物質，并具有解磷、固氮等作用[14]，且廣泛應用于蔬菜、水果等植株的栽培上[15]。隨后的研究中也發現5406放線菌不僅對小麥幼苗有明顯的促生作用，也可促進辣椒，油菜，茄子的生長[16-19]。在對其抑菌效果研究中發現涇陽鏈霉菌對枯草芽孢桿菌、白菜黑斑病等植物病原菌均有明顯的抑制作用[20]。

在實際大田生產中，單一菌劑往往不夠穩定，達不到預期效果，因此采用菌劑復配，期望得到更好的防病效果。粉紅螺旋聚孢霉(Clonostachysrosea)是一種重要的生防菌，能促進植物的生長，并抑制病原菌生長，張潔等[21]發現粉紅螺旋聚孢霉NF-06可有效降低土壤中根結線蟲數量，隨后發現其還可抑制林果枝干中的葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和黑腐皮殼菌(Valsamali)[22]，田甜發現施用棉隆和粉紅螺旋聚孢霉可有效防治黃瓜枯萎病[23]。

目前，雖對5406放線菌開展了一系列的研究，還沒有試驗表明5406放線菌對西瓜的防病促生作用。因此，本試驗設計研究5406放線菌對西瓜幼苗的生長及對西瓜枯萎病的防控效果，為5406放線菌菌劑在西瓜田間生產施用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

5406放線菌：購自中國農業微生物菌株保藏管理中心(ACCC)。

西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.niveum(F1)：由北京市農林科學院植物保護環境保護研究所保存。

粉紅螺旋聚孢霉(Clonostachysrosea)(GR02)：由北京市農林科學院植物保護環境保護研究所保存。

1.1.2 供試品種

西瓜種子：京研益農京闌F1。

枯萎病感病西瓜品種“YX”：由北京市農林科學院蔬菜研究中心西瓜課題組提供。

1.1.3 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：200 g土豆、20 g葡萄糖、15～20 g瓊脂，pH=7.2～7.4，定容至1 L。

馬鈴薯葡萄糖培養基(PD)：200 g土豆、20 g葡萄糖、pH=7.2～7.4，定容至1 L。

種子培養基：蛋白胨40 g、蔗糖15 g、甘油15 mL、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCO30.5 g、NaCl 0.5 g、KH2PO40.5 g。

5406發酵培養基：豆粕粉20 g、高峰淀粉酶0.05 g、玉米淀粉30 g、NaCl 7.5 g、葡萄糖10 g、蛋白胨6 g、CaCO34 g、(NH4)2SO42.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、KH2PO40.3 g[24]。

粉紅螺旋聚孢霉(GR02)發酵培養基：土壤400 g、麩皮800 g、玉米芯350 g、水600 g，混勻后121 ℃滅菌30 min。

1.2 5406放線菌抑菌活性測定

將西瓜枯萎病病菌活化于PDA平板上，放置25 ℃培養箱中培養5～7 d后，取7 mm菌餅接種于平板中央，兩側等距接種5406放線菌，未接種病原菌平板作為空白對照，重復3次，置于25 ℃培養箱培養，觀察其對西瓜枯萎病菌的抑制效果。

抑菌率=[(對照病原菌直徑-與拮抗菌對峙的病原菌直徑)/對照組病菌直徑]×100%

(1)

1.3 育苗

將西瓜種子消毒處理后，置于65 ℃水中浸泡40 min，降至室溫后繼續浸泡培養3 h，將種子置于內含潤濕濾紙的無菌培養皿內，隨時灑水保持濕度，28 ℃培養催芽后，將露白的種子播入育苗盤中，待幼苗長至兩葉一心時移至營養缽中。

1.4 菌劑制備

5406菌劑制備：將保存于-80 ℃菌種活化于PDA平板，28 ℃，培養7 d，純化后菌絲及孢子刮下，接種于種子培養基中，28 ℃，180 r/min，培養36 h后，按8%接種量轉接到發酵培養基中繼續培養36 h，發酵完成后，干燥并粉碎，留以備用。

西瓜枯萎病菌孢子懸液制備：將純化好的菌株F1菌餅倒置于PDA平板，28 ℃，培養3 d后接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PD)中，28 ℃，200 r/min培養7 d，調至孢子濃度為5×106cfu/mL[25]。

粉紅螺旋聚孢霉(GR02)菌劑制備：挑取生長好的GR02接種到PD液體培養基中，25 ℃，180 r/min，培養24 h后按體積分數10%轉接到發酵培養基中，培養14 d，使孢子量達到4×109cfu/mL。

1.5 不同劑量5406放線菌菌劑對西瓜幼苗的促生作用

營養土經高壓滅菌后分裝入育苗盤，按每營養缽含0 g(CK)和0.25 g濃度為2.5×108cfu/g、0.5 g濃度為5×108cfu/g、1.0 g 濃度為1×109cfu/g 5406放線菌菌劑的量[26]，菌劑與土充分混勻后分裝至營養缽中，選取長勢較為一致的西瓜幼苗移栽，每個處理3次重復，15 d后，對西瓜幼苗的生長指標(株高、莖粗、植株鮮重和干重)進行測定。

株高：用直尺測量植株莖基部到頂部的距離。

莖粗：用游標卡尺測量中部莖粗度。

植株鮮重與干重：植株洗凈后用電子天平測量其鮮重，65 ℃烘干，測定干重。

1.6 不同劑量5406放線菌菌劑對西瓜枯萎病盆栽防效的測定

待西瓜幼苗長出兩片真葉時，采用浸根接種法進行盆栽試驗[27]。試驗處理如下：分別為清水對照(CK)、單獨接種5406放線菌菌劑(CK+5406)、單獨接種西瓜枯萎病菌(F1)、接種西瓜枯萎病菌(F1)與0.25 g 5406放線菌菌劑(F1+0.25 g 5406)、接種西瓜枯萎病菌(F1)與0.5 g 5406放線菌菌劑(F1+0.5 g 5406)以及接種西瓜枯萎病菌與1.0 g 5406放線菌菌劑(F1+1.0 g 5406)。每個處理3次重復，每個重復共30株。處理10 d后參照Martyn等的分級標準[28]調查統計發病植株病情，并計算枯萎病病情指數和防治效果。

發病率=(發病株數/總株數)×100%

(2)

病情指數=[∑(病級株數×代表值)/(株數總和×發病最重級的代表數值)]×100

(3)

防治效果=[(對照病情指數-處理病情指數)/

對照病情指數]×100%

(4)

1.7 5406放線菌菌劑對西瓜枯萎病的田間防效測定

于北京大興實驗田進行試驗，小區面積為16.2 m2(6 m×2.7 m)，外圍設置保護行，采用隨機區組設計試驗，3個處理條件如下。

(1)對照(CK)：接病對照。

(2)基施+灌根處理：基施1株苗0.1 g粉劑，667 m2用量為3 kg菌劑，灌根5406發酵液(1×108cfu/mL)劑量為稀釋60倍后，每1株苗灌根150 mL。

(3)灌根處理：灌根5406發酵液(1×108cfu/mL)稀釋60倍后，1株苗灌根150 mL。

每處理重復3次，期間每間隔10 d進行一次灌根處理，共3次，30 d后調查(每個處理調查30株)植株病情指數和防治效果。

1.8 5406放線菌與粉紅螺旋聚孢霉復配菌劑對西瓜枯萎病的防治效果

通過盆栽試驗利用復配菌劑對其進行有效防治，期望得到更好的效果。采用5406放線菌菌劑5×108cfu/g和粉紅螺旋聚孢霉(GR02)含量5×108cfu/g，1∶1充分混勻，盆栽試驗方法同1.6，試驗共分為五個處理方式：清水對照(CK)，單獨接種西瓜枯萎病菌(F1)，單獨接種5406放線菌菌劑(5×108cfu/g)，單獨接種粉紅螺旋聚孢霉GR02(5×108cfu/g)，復配菌劑中5406放線菌菌劑含量為2.5×108cfu/g，粉紅螺旋聚孢霉GR02含量為2.5×108cfu/g。每個處理3次重復，每個重復30株，處理10 d后統計病情指數和防治效果。

1.9 數據分析

數據統計分析利用Excel 2010整理原始數據，同時采用SPSS 22.0軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 5406放線菌抑菌活性測定結果

采用對峙法培養4 d后，可明顯觀察到枯萎病菌菌絲生長受到了抑制，抑菌率為57.50%(圖1)。表明5406放線菌對西瓜枯萎病菌有明顯的抑制效果。

2.2 不同劑量5406放線菌菌劑對西瓜幼苗的促生作用

不同劑量處理的西瓜幼苗的株高、莖粗、鮮重、干重有顯著差異(表1)，對于株高和莖粗的影響中，0.25 g和0.5 g 5406放線菌菌劑顯著高于其他兩個處理，且兩處理間具有顯著差異，1.0 g 5406放線菌菌劑的處理較低于CK，差異不明顯，對于鮮重和干重的影響中，0.5 g 5406放線菌菌劑處理顯著高于其他處理，0.25 g 5406放線菌菌劑處理顯著高于1.0 g 5406放線菌菌劑處理組和CK，而CK與1.0 g 5406放線菌菌劑的處理差異不顯著，根據上述結果表明，施用孢子量為5×108cfu/g的0.5 g 5406放線菌菌劑促進西瓜幼苗的生長效果最明顯。

表1 不同劑量5406放線菌菌劑對西瓜幼苗生長的影響Table 1 The effect of different content 5406 inocula on the growth of watermelon seedlings

2.3 不同劑量5406放線菌菌劑對西瓜枯萎病盆栽防效的測定

接病菌株大約7 d開始發病，經F1處理后幼苗整株明顯呈褐色枯萎(圖2)，F1+5406放線菌菌劑處理的西瓜幼苗病害程度明顯降低，且新葉無病癥，表明5406放線菌菌劑對西瓜枯萎病有明顯的防治效果。

圖2 5406放線菌對西瓜枯萎病的防治效果Fig.2 Control effects of 5406 actinomycetes on fusarium wilt of watermelon

由表2可知，接種5406放線菌菌劑的處理相比單接病原菌F1處理顯著降低了發病率和病情指數，其中F1+0.5 g 5406放線菌菌劑處理與單接種F1處理相比，發病率降低了70.12%，病情指數降低了41.44，效果最好，F1+0.25 g 5406放線菌菌劑處理與單接種F1處理相比，發病率降低了64.34%，病情指數降低了35.54，F1+1.0 g 5406放線菌菌劑處理與單接種F1處理相比，發病率降低了67.80%，病情指數降低了39.22。不同接種量處理間也存在差異，接種0.5 g 5406放線菌菌劑的處理組防治效果高于接種0.25 g和1.0 g處理組，防治效果可達60.44%，效果最好，接種1.0 g 5406放線菌菌劑處理的防治效果顯著高于接種0.25 g處理組，其防治效果為53.29%，而0.25 g 5406放線菌菌劑處理防治效果為48.29%。三種接種5406放線菌菌劑均可抑制西瓜枯萎病，綜合上述結果，施用孢子量為5×108cfu/g的0.5 g 5406放線菌菌劑為最優劑量。

表2 不同處理對西瓜枯萎病的防治效果Table 2 Control effects of different treatments on fusarium wilt of watermelon

2.4 5406放線菌菌劑對西瓜枯萎病田間防效的測定

在田間針對5406放線菌菌劑對西瓜枯萎病的防效進行測定后發現，經過基施和灌根處理后，具有較高的防治效果，可達62.12%(表3)，病情指數較對照顯著下降了35.00，灌根處理也具有一定防治效果，但效果較基施和灌根處理組差，防治效果達32.29%，病情指數降低了18.19，防治效果不明顯。結果表明5406放線菌菌劑不僅在室內具有良好的抑菌效果，而且在田間也可保持較好的生物活性。

表3 不同處理對西瓜枯萎病的田間防效Table 3 Field effects of different treatments on fusarium wilt of watermelon

2.5 5406放線菌和粉紅螺旋聚孢霉復配菌劑對西瓜枯萎病的防治效果

復配菌劑的盆栽試驗結果表明復配菌劑處理組防治效果較好，顯著高于單獨接種5406放線菌菌劑處理組和單獨接種粉紅螺旋聚孢霉GR02菌劑處理組，較單獨接種西瓜枯萎病菌F1處理組顯著降低了發病率，防治效果可達68.24%(表4)，單獨施用5406放線菌菌劑和單獨施用粉紅螺旋聚孢霉GR02菌劑發病率也明顯降低，但二者間差異不顯著，防治效果分別為61.89%和64.34%，從試驗可以明顯看出施用復配菌劑比單獨施用菌劑防病效果好，可以后續開發并大量使用。

表4 5406放線菌和粉紅螺旋聚孢霉復配菌劑對 西瓜枯萎病的防治效果Table 4 Control effect of 5406 actinomycetes combination with Clonostachys rosea on fusarium wilt of watermelon

3 討論和結論

放線菌菌劑具有易長期保存，便于運輸等特點。5406放線菌作為一種生防菌，能夠產生抗菌素，分泌細胞分裂素等刺激植物生長的物質，促進葉綠素含量的增加，對植物根系的生長有促進作用，并具有提高酶的生物活性，緩解連作障礙，促進土壤中氮、磷的轉化等特點，現已逐步應用于農業生產中。

研究通過平板對峙法，測定5406放線菌對西瓜枯萎病菌具有明顯抑制效果，并通過試驗表明5406放線菌菌劑對西瓜幼苗有促生效果，使西瓜的株高、莖粗、鮮重及干重含量均明顯增加，其中，孢子量為5×108cfu/g的0.5 g 5406放線菌菌劑的處理效果最明顯，為最佳施用劑量。本試驗結果與崢嶸[16]的研究結果相符，表明5406放線菌菌劑對幼苗的促生作用具有普遍性。

目前，大田中常以多菌靈，甲基托布津等化學藥劑抑制西甜瓜枯萎病，此方法雖見效快，易操作，但長期施用單一藥劑易產生農藥殘留，危害人類健康并造成環境污染[29]。因此發現并研究高效無毒害的生物菌劑是科研人員的重要任務。任遷琪等[2]發現鏈霉菌屬F32對西瓜枯萎病有較好的防效，利迪鏈霉菌[30](S.lydicus)也可抑制西瓜枯萎病的生長。本試驗所施用5406放線菌菌劑對西瓜枯萎病的防治效果較好，其中0.5 g 5406放線菌菌劑的防效可達60.44%。通過田間防效測定發現5406菌劑基施和灌根處理時，西瓜枯萎病病情指數顯著降低了35.00，防治效果可達62.12%，結果表明在大田此生防菌株也具有較好的抑菌活性。

綜上結果所示，施用5406放線菌菌劑具有促進西瓜幼苗生長的作用，同時對西瓜枯萎病有較好的抑制效果，其中孢子量為5×108cfu/g的0.5 g 5406放線菌菌劑的防病促生效果最好；在大田試驗中也有明顯防治成效，基施和灌根處理防效可達62.12%，復配菌劑5406放線菌和粉紅螺旋聚孢霉(GR02)對西瓜枯萎病的防治效果優于單一菌劑處理，達到68.24%。但目前使用微生物菌劑仍處于探索階段，且5406放線菌抗菌機制暫不清晰，因此還將對其進一步研究，為后續抑菌物質的開發和應用微生物菌肥的應用奠定基礎。