5種尿液修飾核苷聯(lián)合血漿EBV-DNA定量檢測(cè)在鼻咽癌診斷中的可行性研究

茅飛霞 張毅敏 張劍英▲

1.中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（浙江省腫瘤醫(yī)院）檢驗(yàn)科，浙江杭州 310022；2.中國科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與腫瘤研究所，浙江杭州 310022

鼻咽癌是一種發(fā)生在鼻咽上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，具有明顯的地域聚集性，以我國南方和東南亞地區(qū)常見。該病起病隱匿，大部分患者確診時(shí)已是中晚期，臨床治療效果不佳，因此在目前病因不明無法進(jìn)行一級(jí)預(yù)防的情況下，準(zhǔn)確的早期診斷是鼻咽癌防治的關(guān)鍵。現(xiàn)已公認(rèn)，Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[1]，但是單純EBV感染并不一定引起鼻咽癌的發(fā)生。RNA修飾核苷是機(jī)體RNA的代謝產(chǎn)物，尿中修飾核苷的排量可以反映機(jī)體細(xì)胞的代謝速度，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)這些修飾核苷與腫瘤發(fā)生有關(guān)，是潛在的腫瘤標(biāo)志物，具有腫瘤譜廣、取材方便、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)[2]。本研究通過檢測(cè)鼻咽癌患者尿液中假尿嘧啶核苷（pseudouridine，Pseu）、1-甲基腺苷（1-methyladenosine，m1A）、2-甲基鳥苷（2-O-methylguanosine，m2G）、6-甲基腺苷（6-methyladenosine，m6A）和1-甲基鳥苷（1-methylguanosine，m1G）5種修飾核苷的濃度以及血漿EBV-DNA的拷貝數(shù)，旨在探討尿液5種修飾核苷與血漿EBV-DNA聯(lián)合檢測(cè)在鼻咽癌診斷中的可行性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1～6月浙江省腫瘤醫(yī)院收治的56例初診鼻咽癌患者作為鼻咽癌組，男36例，女20例；年齡15～73歲，平均（52.68±13.26）歲。鼻咽癌按照第8版AJCC的分期標(biāo)準(zhǔn)[3]，臨床分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期3例，Ⅲ期23例，Ⅳa期20例，Ⅳb期7例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度：N05例，N121例，N223例，N37例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為鼻咽癌；②全部接受抗腫瘤治療前。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在影響RNA代謝的疾病，如泌尿系感染和腎功能不全、內(nèi)分泌異常、酗酒等情形；②合并鼻咽癌外其他臟器的惡性腫瘤病史。同時(shí)選取門診查體的32例健康體檢者作為正常對(duì)照組，男19例，女13例；年齡25～68歲，平均（49.25±11.86）歲。兩組的性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)浙江省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)并征得患者及其家屬知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)尿液中5種核苷的濃度

1.2.1.1 儀器和試劑AB SCIEX TRIPLE QUAD 5500超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有Analyst 1.4數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國AB SCIEX公司）。5種修飾核苷標(biāo)準(zhǔn)品分別為Pseu、m1A、m6A、m1G（加拿大TRC公司）及m2G（中國Meryer公司）。

1.2.1.2 尿樣預(yù)處理 鼻咽癌組患者于治療前采集尿樣，健康體檢者采集隨機(jī)尿樣。樣本收集后存放于-80℃冰箱，測(cè)定前室溫復(fù)溶。4℃15 000 r/min離心15 min，取上清100 μL至15 mL離心管內(nèi)，再加入4900 μL超純水，渦旋10 min。取上述稀釋后樣本100 μL于1.5 mL離心管中，再加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液，4℃13 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)樣分析。

1.2.1.3 色譜條件 選用Agilent Proshell 120 EC-C18色譜柱（3.0 mm×50 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相（A）為0.1%甲酸/水溶液，流動(dòng)相（B）為0.1%甲酸/甲醇溶液；梯度洗脫：0～0.5 min，1% B；0.5～8.0 min，1%～15% B；8～9 min，15%～100%B；9～10 min，100%B；10.0～10.5 min，100%～1% B；10.5～12.0 min，1% B。進(jìn)樣量15 μL，流速為0.3 mL/min；柱溫為30℃。

1.2.1.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）。離子源參數(shù)：氣簾氣壓為20 Psi，碰撞氣壓為8 Psi，離子噴霧電壓為5500 V，離子源溫度為550℃。

1.2.1.5 肌酐值測(cè)定 以隨機(jī)尿樣為研究對(duì)象，采用日立7100型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肌酐濃度（酶法測(cè)定），嚴(yán)格按照說明書操作。以核苷與肌酐濃度比值[nmol/μmol（creatinine）]為研究指標(biāo)，反映尿液中核苷的水平。

1.2.2 采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)檢測(cè)EBV-DNA的拷貝數(shù)

1.2.2.1 樣本預(yù)處理 采集靜脈血3 mL，加入EDTA抗凝管中，2000 r/min離心5 min，取200 μL血漿于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 EBV-DNA的提取及PCR擴(kuò)增 將凍存血漿置于室溫環(huán)境復(fù)溶，嚴(yán)格按照EBV熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）說明書進(jìn)行DNA提取。將混合的PCR反應(yīng)液在LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量RCR儀（瑞士Roche公司）上進(jìn)行基因擴(kuò)增檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性2 min，93℃5 s，57℃45 s，40個(gè)循環(huán)，37℃冷卻。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組的血漿EBV-DNA拷貝數(shù)、尿液中5種修飾核苷濃度，分析尿液m2G、m1A、Pseu、m1G與鼻咽癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并分析血漿EBV-DNA與尿液m2G、m1A、Pseu、m1G單獨(dú)及5項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)診斷鼻咽癌的價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；部分計(jì)量資料偏態(tài)分布用中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，組間比較采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析；利用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析單項(xiàng)或多項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能，多項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷先通過Logistic回歸形成聯(lián)合預(yù)測(cè)因子再構(gòu)建ROC曲線，ROC曲線下面積（AUC）比較采用Z檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿EBV-DNA拷貝數(shù)的比較

鼻咽癌組的血漿EBV-DNA拷貝數(shù)為108 copies/mL（0～4340 copies/mL），正常對(duì)照組的血漿EBV-DNA拷貝數(shù)為55 copies/mL（0～1326 copies/mL），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=3.478，P=0.001）。

2.2 兩組尿液中5種修飾核苷濃度的比較

鼻咽癌組尿液中的m2G、Pseu、m1A、m1G濃度均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組尿液中的m6A濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 兩組尿液中5種修飾核苷濃度的比較[nmol/μmol（creatinine），±s]

表1 兩組尿液中5種修飾核苷濃度的比較[nmol/μmol（creatinine），±s]

鼻咽癌組正常對(duì)照組t值P值56 32 1.17±0.31 0.74±0.22 6.980 0.000 38.16±9.01 29.52±6.15 5.307 0.000 4.94±1.20 3.53±0.75 6.821 0.000 0.01±0.01 0.01±0.01 1.155 0.251 0.97±0.21 0.69±0.18 6.255 0.000組別 例數(shù) m2G Pseu m1A m6A m1G

2.3 尿液Pseu、m1A、m1G、m2G與鼻咽癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

單因素分析結(jié)果顯示，不同臨床分期的Pseu濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度的Pseu、m2G濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同臨床分期的m1A、m1G、m2G濃度比較及不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度的m1A、m1G濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 尿液Pseu、m1A、m1G、m2G與鼻咽癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[nmol/μmol（creatinine），±s]

表2 尿液Pseu、m1A、m1G、m2G與鼻咽癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[nmol/μmol（creatinine），±s]

臨床分期Ⅰ期+Ⅱ期Ⅲ期Ⅳa期Ⅳb期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0 N1 N2 N3 6 23 20 7 52 1 23 7 25.03±8.56 37.38±6.49 40.41±8.40 45.51±7.77 28.20±9.09 36.83±9.71 39.45±5.61 45.30±10.17 8.840 4.494 0.000 0.007 4.40±1.22 4.67±0.92 5.13±1.36 5.72±1.24 3.73±0.89 4.90±1.38 5.13±0.94 5.32±1.13 2.058 2.279 0.182 0.090 0.92±0.19 0.95±0.21 1.01±0.19 1.06±0.26 0.86±0.24 0.94±0.20 0.97±0.19 1.12±0.20 1.894 1.796 0.153 0.159 0.94±0.19 1.14±0.25 1.24±0.37 1.26±0.31 0.90±0.11 1.19±0.29 1.12±0.22 1.46±0.48 1.829 4.156 0.153 0.010項(xiàng)目 例數(shù) Pseu F值 P值 m1A F值 P值 m1G F值 P值 m2G F值 P值

相關(guān)分析結(jié)果顯示，Pseu濃度與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)（r=0.474、0.406，P＜0.01）；m2G濃度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性（r=0.259，P＞0.05）。

2.4 血漿EBV-DNA與尿液m1A、Pseu、m2G、m1G單獨(dú)及5項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)診斷鼻咽癌的ROC曲線分析

通過Logistic回歸形成m2G、m1A、Pseu、m1G及EBV-DNA 5項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的聯(lián)合預(yù)測(cè)因子，將聯(lián)合預(yù)測(cè)因子作為新變量與EBV-DNA、m2G、m1A、Pseu、m1G一起進(jìn)行ROC曲線分析并進(jìn)行診斷效能的評(píng)價(jià)，結(jié)果見表3、圖1（封三）。Z檢驗(yàn)結(jié)果顯示：5項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的AUC均高于血漿EBV-DNA和尿液m2G、m1A、Pseu、m1G單項(xiàng)檢測(cè)（Z=4.655、3.010、3.484、4.222、3.484），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在特異性為90%時(shí)，血漿EBV-DNA和尿液Pseu、mlA、mlG、m2G單項(xiàng)檢測(cè)的敏感度分別為46.4%、51.8%、57.1%、53.6%、76.8%，而5項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的敏感度可達(dá)89.3%。

表3 血漿EBV-DNA與尿液m1A、Pseu、m2G、m1G單獨(dú)及5項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)診斷鼻咽癌的AUC

圖1 血漿EBV-DNA與尿液m1A、Pseu、m2G、m1G單獨(dú)及5項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)診斷鼻咽癌的ROC曲線

3 討論

根據(jù)2019年《鼻咽癌標(biāo)志物臨床應(yīng)用專家共識(shí)》[4]，血漿EBV-DNA是目前臨床應(yīng)用最廣泛、最成熟的鼻咽癌診斷、療效和預(yù)后判斷標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，鼻咽癌患者與對(duì)照組比較，其EBV-DNA拷貝數(shù)升高（P＜0.05），再一次證實(shí)EB病毒感染與鼻咽癌發(fā)生的密切相關(guān)。此外，本研究中鼻咽癌患者血漿EBV-DNA拷貝數(shù)為107copies/mL（0～4340 copies/mL），明顯低于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)[5-6]。王惠麗等[7]研究發(fā)現(xiàn)，治療前鼻咽癌患者血漿血漿EBV-DNA拷貝數(shù)為134 copies/mL，與本研究結(jié)果相似，分析原因認(rèn)為可能與接受治療的患者主要祖籍為北方而非來自鼻咽癌高發(fā)區(qū)有關(guān)。Alfieri等[8]發(fā)現(xiàn)意大利非高發(fā)區(qū)患者治療前EBV-DNA的中位拷貝數(shù)數(shù)為554 copies/mL，也明顯低于高發(fā)區(qū)患者的水平。由此認(rèn)為本研究中患者治療前血漿EBV-DNA水平較低可能與研究對(duì)象來自東部并非來自鼻咽癌高發(fā)區(qū)有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

RNA修飾核苷屬于內(nèi)源性小分子，主要存在于tRNA中[9]，由RNA轉(zhuǎn)錄后在多種特異性修飾酶，尤其是甲基轉(zhuǎn)移酶和連接酶的作用下，RNA鏈上特定位置的核苷被修飾而形成。修飾核苷不能被機(jī)體重新利用而在尿中定量排放，腫瘤細(xì)胞核糖核酸周轉(zhuǎn)加快，導(dǎo)致其產(chǎn)生和排出增多。目前已發(fā)現(xiàn)的修飾核苷有90多種，近年來的研究發(fā)現(xiàn)其中有二十多種修飾核苷是非常有潛力的分子標(biāo)志物，在多種類型腫瘤患者尿液中排放水平較正常人顯著升高[10-12]。

Pseu是被研究得最多的一種修飾核苷[11]。尿嘧啶與核糖在核苷磷酸酶的作用下生成尿嘧啶核苷，之后被尿苷激酶催化生成尿嘧啶核苷酸，經(jīng)tRNA合成酶催化特定部位尿嘧啶核苷酸形成Pseu[13]。在包括前列腺癌、卵巢癌、肺癌等多種常見腫瘤中均發(fā)現(xiàn)患者尿液中Pseu濃度較正常對(duì)照顯著升高，被認(rèn)為是核苷中最有潛力的廣譜分子標(biāo)志物[10-11，14]。Pérez-Rambla等[10]在建立評(píng)估前列腺癌尿液代謝組學(xué)模型研究中發(fā)現(xiàn)，與前列腺良性增生患者比較，前列腺癌患者尿液Pseu顯著升高（P＜0.05）。本研究結(jié)果顯示，鼻咽癌患者尿液Pseu濃度與對(duì)照組比較顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與Trewyn等[15]研究結(jié)果相似。利用ROC曲線進(jìn)行診斷效能的評(píng)價(jià)，顯示其具有較高的診斷價(jià)值（AUC=0.803），提示Pseu可能是鼻咽癌的一種分子標(biāo)志物，有助于鼻咽癌的診斷。另外，相關(guān)分析結(jié)果顯示，Pseu濃度與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)（P＜0.05），與Jiang等[14]卵巢癌中的研究結(jié)果相似，提示Pseu可能參與鼻咽癌的進(jìn)展和演進(jìn)過程。

在尿液修飾核苷產(chǎn)生過程中，甲基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮重要作用[16]。在腫瘤細(xì)胞中，由于編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)異常，其水平和活性發(fā)生異常[17]，從而導(dǎo)致修飾核苷水平增高。在所有核苷修飾類型中，甲基化是最常見的修飾，m2G、m1A、m1G均屬于甲基化修飾的核苷[18]。馮璐等[19]等研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者尿液中mlA、mlI、mlG及m2G濃度均顯著高于正常對(duì)照者（P＜0.01），認(rèn)為尿液中4種修飾核苷可能成為肺癌診斷的分子標(biāo)志物。本研究中，鼻咽癌組尿液中的m2G、m1A、m1G濃度均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），m2G、m1A、m1G的AUC分 別 為0.911、0.860、0.845，具有較高的診斷價(jià)值，提示該3種修飾核苷可能是鼻咽癌診斷的分子標(biāo)志物。此外，本研究進(jìn)一步采用Logistic回歸和ROC曲線分析，結(jié)果顯示，m2G、m1A、Pseu、m1G、EBV-DNA 5項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的AUC均高于m2G、m1A、Pseu、m1G、EBV-DNA單項(xiàng)檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在特異性為90%時(shí)，血漿EBV-DNA和尿液Pseu、mlA、mlG、m2G單項(xiàng)檢測(cè)的敏感度分別為46.4%、51.8%、57.1%、53.6%、76.8%，而聯(lián)合檢測(cè)的敏感度可達(dá)89.3%。提示5項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)在鼻咽癌可能具有較高的診斷價(jià)值，且可能有助于提高診斷的敏感度。

綜上所述，鼻咽癌患者尿液中修飾核苷m2G、m1A、Pseu、m1G有望成為診斷鼻咽癌的小分子標(biāo)志物，Pseu可能參與鼻咽癌的發(fā)展演進(jìn)過程。通過m2G、m1A、Pseu、m1G與EBV-DNA聯(lián)合檢測(cè)可能有助于提高鼻咽癌臨床診斷的診斷效能，有利于患者的早診斷、早發(fā)現(xiàn)，具有較好的臨床前景。