彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者化療前后淋巴細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)變化及其意義

余 璐 丁凱陽(yáng)

1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院血液科，安徽合肥 230032；2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院血液腫瘤科，安徽合肥 230032

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）中的一種，其約占成人NHL的30%～40%[1]。隨著醫(yī)療水平的提高有更多患者可被診斷，而且隨著各種治療手段的應(yīng)用，DLBCL患者的生存期明顯延長(zhǎng)，但是，仍有約30%～40%患者出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)或難治，預(yù)后較差[2]。近年，細(xì)胞免疫治療在淋巴瘤中廣泛應(yīng)用，外周血T細(xì)胞亞群在正常人群中作用十分重要，它是細(xì)胞免疫的重要組成部分，機(jī)體免疫力改變時(shí)它也會(huì)隨之發(fā)生一系列的改變。B細(xì)胞相關(guān)淋巴瘤與外周血免疫功能狀態(tài)的研究結(jié)果提示，B細(xì)胞相關(guān)淋巴瘤患者淋巴細(xì)胞亞群存在變化，目前很多藥物也是依賴淋巴細(xì)胞發(fā)揮作用的，這些新的治療方法為惡性血液病的治療帶來(lái)了新的方向[3]。但是，目前缺乏對(duì)淋巴細(xì)胞亞群與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后之間的研究，本研究對(duì)56例DLBCL患者的臨床病理特征進(jìn)行了分析，旨在探索DLBCL治療前后的免疫功能是否存在變化，化療前后淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生何種變化，探討不同臨床特征的DLBCL患者對(duì)預(yù)后的影響，以期初步建立外周血淋巴細(xì)胞亞群與DLBCL預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院2018年5月～2020年5月首次就診的56例DLBCL患者作為研究對(duì)象，所有患者均經(jīng)病理確診，按照化療前外周血CD4+/CD8+比值分為升高/正常組（A組）39例和降低組（B組）17例。A組中，男24例，女15例；年齡25～78歲，平均（57.3±10.9）歲；病程7～31個(gè)月。B組中，男9例，女8例；年齡28～85歲，平均（58.4±14.0）歲；病程11～32個(gè)月。兩組患者的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②所有患者均符合《中國(guó)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤診斷與治療指南（2013年版）》[4]；③美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組（ECOG）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]體力評(píng)分0～3分；④可接受標(biāo)準(zhǔn)的R-CHOP方案化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①目前患有其他惡性腫瘤，或既往患有惡性腫瘤未行根治性治療，近5年內(nèi)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移；②合并無(wú)法控制的、嚴(yán)重的心腦血管疾病，如不穩(wěn)定性心絞痛、心肌梗死、需要治療的心房纖顫、Ⅱ級(jí)以上心力衰竭等；③合并活動(dòng)性出血或有明確出血傾向者；④有深靜脈血栓或肺栓塞病史者；⑤活動(dòng)性感染或未控制的乙型病毒性肝炎（HBV）、丙型肝炎抗體（HCVAb）陽(yáng)性、艾滋病（AIDS）或其他嚴(yán)重感染性疾病；⑥既往或目前有肺纖維化、間質(zhì)性肺炎、塵肺、放射性肺炎、藥物相關(guān)肺炎、肺功能?chē)?yán)重受損等；⑦存在精神認(rèn)知障礙；⑧妊娠及哺乳期婦女；⑨合并風(fēng)濕免疫功能性疾病；⑩其他不適用美羅華或CHOP的疾病或情況。

1.2 方法

根據(jù)患者情況制定個(gè)體化的化療藥物及劑量，以標(biāo)準(zhǔn)R-CHOP[6]為基礎(chǔ)，具體如下。

d 0，利妥昔單抗（R）[Roche Pharma（Schweiz）AG；規(guī)格：100 mg/10mL；國(guó)藥準(zhǔn)字：S20170002]375 mg/m2；d1，環(huán)磷酰胺（C）（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；規(guī)格：0.2 g；國(guó)藥準(zhǔn)字：H32020857）750 mg/m2，表柔比星（H）（瀚暉制藥有限公司；規(guī)格：10 mg；國(guó)藥準(zhǔn)字：H19990280）70 mg/m2，長(zhǎng)春新堿（O）（山西振東泰盛制藥有限公司；規(guī)格：1 mg；國(guó)藥準(zhǔn)字：H14020811）1.4 mg/m2；d 1～5，潑尼松（P）（山東新華制藥股份有限公司；規(guī)格：5 mg；國(guó)藥準(zhǔn)字：H37020647）60 mg/m2。每21天一個(gè)周期，化療同時(shí)給予止吐，水化、堿化及其他對(duì)癥治療。

R-CHOP方案化療四周期后進(jìn)行中期評(píng)估。評(píng)估結(jié)果適合移植患者采用移植強(qiáng)化治療，或者根據(jù)患者病情調(diào)整使用二線治療方案、CRT-T治療方案等，根據(jù)患者的年齡、臟器功能狀態(tài)等綜合因素考慮是否加用或減少化療藥物劑量。患者空腹時(shí)采集外周血，完成生化、血常規(guī)、T細(xì)胞亞群水平的檢查，使用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)對(duì)患者外周血的淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，包括淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD3+CD4+（簡(jiǎn)稱為CD4+）、CD3+CD8+（簡(jiǎn)稱為CD8+）、CD3+CD4+/CD3+CD8+（簡(jiǎn)稱為CD4+/CD8+）化療前后的動(dòng)態(tài)變化情況，結(jié)果用百分?jǐn)?shù)（%）表示。該項(xiàng)檢查由檢驗(yàn)科專(zhuān)業(yè)醫(yī)師完成，使用化療藥物前行影像學(xué)檢查，包括PET-CT、臟器彩超及臟器CT。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

觀察患者的臨床特征、化療前后淋巴細(xì)胞亞群的變化、患者的預(yù)后及不良反應(yīng)發(fā)生情況。

1.3.1 臨床特征 記錄比較患者的性別、年齡、病變部位、Ann Arbor分期、血清乳酸脫氫酶（LDH）水平、雙表達(dá)情況、β2微球蛋白、ECOG評(píng)分、有無(wú)B癥狀。其中LDH正常值范圍120～250 IU/L，β2微球蛋白＞1.80 mg/L為升高。雙表達(dá)的定義為患者的病理組織經(jīng)免疫組化檢查后MYC和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因2（BCL-2）表達(dá)分別達(dá)到40%以上和70%以上[6-7]。

1.3.2 化療前后淋巴細(xì)胞亞群的變化CD3+正常值范圍59.4%～84.6%；CD4+正常值范圍28.5%～60.5%；CD8+正常值范圍11.1%～38.3%；CD4+/CD8+正常值范圍1.10%～1.72%。

1.3.3 化療后情況 化療四個(gè)周期后，按照《中國(guó)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤診斷與治療指南（2013年版）》[4]對(duì)患者治療效果進(jìn)行評(píng)估，包括行全身PET-CT、外周血檢驗(yàn)及骨髓檢查，評(píng)估結(jié)果包括：完全緩解（CR）即病灶疾病消失、部分緩解（PR）即病灶明顯減少、穩(wěn)定（SD）即病灶無(wú)明顯改變和進(jìn)展（PD）即有新病灶出現(xiàn)，有效包括CR及PR，無(wú)效包括SD和PD。記錄患者的隨訪時(shí)間及無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間。無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間為從開(kāi)始治療到疾病復(fù)發(fā)/進(jìn)展或任何原因死亡或隨訪終點(diǎn)的時(shí)間。

1.3.4 不良反應(yīng) 化療四周期后再按照外周血CD4+/CD8+比值分為升高/正常組（C組）和降低組（D組），比較兩組不良反應(yīng)發(fā)生情況，包括粒細(xì)胞減少、血小板減少、貧血及肝功能損害。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有的數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；對(duì)于符合正態(tài)正態(tài)分布的計(jì)量資料，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式進(jìn)行描述，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對(duì)于不符合正態(tài)分布的資料，用中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）[M（P25，P75）]進(jìn)行描述，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL患者化療后的整體情況

56例DLBCL初診患者中，45例患者存在結(jié)外病變，11例患者未發(fā)生結(jié)外病變。化療四個(gè)周期后全身PET-CT結(jié)果提示，CR者41例，符合淋巴瘤完全緩解的表現(xiàn)，PR者12例，SD者2例，PD者1例。中期評(píng)估結(jié)果，治療有效53例，無(wú)效3例。所有患者隨訪至2020年12月10日，隨訪時(shí)間7～31個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為18個(gè)月，到隨訪結(jié)束時(shí)共有10例患者病情進(jìn)展（其中死亡1例），病情穩(wěn)定者46例。

2.2 DLBCL患者臨床特征分布情況

初診患者CD4+/CD8+比值與性別、年齡、病變部位、ECOG、血清β2微球蛋白水平、是否雙表達(dá)及有無(wú)B癥狀無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），而與Ann Arbor分期、血清LDH水平有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 DLBCL患者臨床特征分布情況[M（P25，P75）]

2.3 化療前后淋巴細(xì)胞亞群變化情況

化療后患者的CD3+、CD8+高于化療前，CD4+/CD8+低于化療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而CD4+化療前后比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 化療前后淋巴細(xì)胞亞群變化情況（±s）

表2 化療前后淋巴細(xì)胞亞群變化情況（±s）

治療前治療后t/U值P值70.833±12.520 79.535±9.600 5.605 0.000 39.058±10.812 40.034±11.040 0.608 0.546 28.920±9.208 36.590±11.067 6.360 0.000 1.335（1.025，1.775）1.135（0.770，1.545）5.388 0.000時(shí)間 CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+[M（P25，P75）]

2.4 A組和B組患者化療后情況的比較

A組復(fù)發(fā)/進(jìn)展3例（7.69%），B組復(fù)發(fā)/進(jìn)展7例（41.18%），B組復(fù)發(fā)/進(jìn)展患者人數(shù)多于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.049，P=0.006）。

A組和B組無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間的中位時(shí)間分別為17個(gè)月和15個(gè)月，A組患者的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間為（18.0±7.0）個(gè)月，長(zhǎng)于B組的（12.5±6.6）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.575，P＜0.05）。

2.5 C組和D組患者不良反應(yīng)發(fā)生情況

化療四周期后再按照外周血CD4+/CD8+比值分為升高/正常組（C組）31例和降 低組（D組）25例。兩組患者粒細(xì)胞減少、貧血及肝功能損害發(fā)生情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），D組血小板減少的發(fā)生率高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 C組和D組患者治療后不良反應(yīng)分布情況比較[n（%）]

3 討論

DLBCL是全世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的NHL，約占NHL的30%～40%[1]。DLBCL惡性程度高，隨著靶向治療研究的深入，已經(jīng)建立針對(duì)CD20+的DLBCL患者的治療標(biāo)準(zhǔn)方案，即R-CHOP方案（美羅華、環(huán)磷酰胺、表柔比星、長(zhǎng)春新堿、潑尼松）[8]。目前外周血LDH、β2微球蛋白已經(jīng)被證明是與DLBCL預(yù)后相關(guān)的因素[9]。大多數(shù)患者經(jīng)過(guò)規(guī)律的R-CHOP方案治療后可以達(dá)到緩解，但是仍有約40%的DLBCL患者會(huì)進(jìn)展為難治性淋巴瘤，甚至在緩解一段時(shí)間后出現(xiàn)病情復(fù)發(fā)[6]，故改善一線治療方案的效果一直是國(guó)內(nèi)外血液腫瘤學(xué)專(zhuān)家關(guān)注的重點(diǎn)。為了讓更多的腫瘤患者受益，專(zhuān)家學(xué)者們做出了不少努力，值得注意的是基于免疫的診療徹底改變癌癥治療的臨床治療預(yù)后，目前新的治療方式廣泛地應(yīng)用到DLBCL的治療中[10]，主要包括伊布替尼（I）[11]、來(lái)那度胺[12]、自體干細(xì)胞移植[13]（auto-HSCT）以及嵌合抗原受體T細(xì)胞[14]（CAR-T）及雙特異性抗體[15]等。這些治療方案發(fā)揮作用時(shí)都或多或少與淋巴細(xì)胞亞群分布相關(guān)。

外周血T細(xì)胞亞群在正常人群中作用十分重要[16]，它是細(xì)胞免疫的重要組成部分，機(jī)體免疫力改變時(shí)它也會(huì)隨之發(fā)生一系列的改變。機(jī)體細(xì)胞免疫主要是依托于淋巴細(xì)胞亞群發(fā)揮作用的，其中實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中CD3+細(xì)胞是代表總的T細(xì)胞數(shù)量，包括效應(yīng)性CD4+和細(xì)胞毒性CD8+淋巴細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）；輔助性T細(xì)胞（Th）是指CD4+淋巴細(xì)胞，CD8+淋巴細(xì)胞則具有抑制誘導(dǎo)及細(xì)胞毒性功能[17]。CD8+是常表現(xiàn)細(xì)胞毒活性，一般來(lái)說(shuō)，CD8+含量愈高，患者的免疫抑制愈強(qiáng)，患者的抵抗力愈弱，CD4+/CD8+在一定程度上更能反應(yīng)機(jī)體的免疫功能，即其比值降低時(shí)免疫功能降低，比值升高時(shí)免疫功能增強(qiáng)。

此前，有研究表明惡性腫瘤患者存在免疫力低下的情況，同時(shí)惡性腫瘤患者的病情發(fā)生進(jìn)展與機(jī)體的免疫功能之間有著緊密的聯(lián)系，檢測(cè)惡性腫瘤患者外周血細(xì)胞亞群有助于了解患者機(jī)體免疫功能狀況[18]。研究NHL患者外周血T細(xì)胞亞群后發(fā)現(xiàn)NHL患者化療后CD3+、CD4+細(xì)胞百分比均顯著增高，CD8+百分比顯著降低[19]，此外冉隆榮等[20]對(duì)惡性血液病研究中發(fā)現(xiàn)15例NHL患者CD4+顯著下降、CD8+比例顯著上升，而非血液系統(tǒng)惡性病變研究[21]發(fā)現(xiàn)患者全血T淋巴細(xì)胞總數(shù)以及其各個(gè)亞群細(xì)胞都是明顯降低的。雖然，關(guān)于淋巴細(xì)胞亞群在惡性腫瘤中動(dòng)態(tài)改變的研究并不少，而且均提示惡性腫瘤患者存在不同程度的免疫功能失調(diào)，但是目前關(guān)于DLBCL患者體內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群分布情況的研究數(shù)據(jù)還不夠完善，因此本研究分析初診DLBCL患者外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果有助于進(jìn)一步了解患者的免疫功能狀態(tài)。

本研究顯示初診患者外周血T細(xì)胞亞群分布情況發(fā)現(xiàn)初診DLBCL患者的免疫功能并不是都受到抑制，只有30%左右患者的CD4+/CD8+出現(xiàn)下降，這可能與淋巴瘤一般以無(wú)痛性包塊發(fā)病，患者常常在體表可捫及腫大的包塊，而且這些包塊不像炎癥包塊那樣可以自動(dòng)消退，這種特別的臨床表現(xiàn)經(jīng)常會(huì)引起患者的重視而就診，因此，大多數(shù)患者從起病到確診的時(shí)間相對(duì)短于其他腫瘤確診時(shí)間，可能正是源于這點(diǎn)，DLBCL患者機(jī)體免疫力還沒(méi)破環(huán)的相對(duì)少；另外，通過(guò)隨訪發(fā)現(xiàn)初始免疫功能受到抑制的患者中有47%發(fā)生疾病進(jìn)展，預(yù)后相對(duì)于初診免疫功能正常的患者差，這提示我們免疫功能缺陷會(huì)影響化療的效果，因此，針對(duì)免疫功能受到抑制的患者在進(jìn)行R-CHOP化療時(shí)可適當(dāng)使用一些增強(qiáng)免疫力的食物或者藥物，在治療期間保證適量的蛋白和維生素的攝取以期增加患者免疫力。

此外，經(jīng)過(guò)四個(gè)周期R-CHOP方案化療后DLBCL患者外周血中的T淋巴細(xì)胞亞群分布發(fā)生了較大的改變，一方面，患者CD3+和CD8+較化療前明顯升高，另一方面，患者的CD4+/CD8+比值明顯下降，兩者比值反映初診患者經(jīng)過(guò)聯(lián)合化療后免疫功能受到一定程度抑制，說(shuō)明首次接受R-CHOP樣化療方案后患者的普遍出現(xiàn)免疫功能下降，發(fā)生這樣的改變可能是因?yàn)槌Ｒ?guī)化療產(chǎn)生耐藥或化療對(duì)機(jī)體免疫功能的破壞后T淋巴細(xì)胞恢復(fù)周期有關(guān)[22]。

本研究結(jié)果亦顯示，首診DLBCL患者中，Ann Arbor分期越遲的患者相對(duì)于分期早的患者的免疫功能低下，而且LDH升高明顯的患者免疫功能也存在一定程度的抑制，考慮到Ann Arbor分期較晚和LDH升高的DLBCL患者免疫功能通常存在不同程度的抑制或是受損，在臨床中對(duì)于LDH升高及Ann Arbor分期較晚的患者在治療方案的劑量選擇及預(yù)防不良反應(yīng)應(yīng)予以重視以提高患者的生活質(zhì)量。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)免疫功能出現(xiàn)抑制后會(huì)發(fā)生各種不良反應(yīng)，而且發(fā)生血小板減低者的患者免疫功能出現(xiàn)明顯抑制，血小板在之止血過(guò)程中承擔(dān)著重要作用[23]，因此，對(duì)于免疫功能下降患者也需要注意患者的出血風(fēng)險(xiǎn)，警惕臟器內(nèi)出血。另一方面，不同免疫功能狀態(tài)患者發(fā)生進(jìn)展及不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)也不一樣，化療過(guò)程中的不良反應(yīng)將在一定程度上影響患者生存質(zhì)量及藥物作用的發(fā)揮。因此，患者處于免疫功能不同接受R-CHOP治療可以適當(dāng)調(diào)整免疫靶向藥物的劑量以降低藥物的免疫抑制作用，從而提高患者的免疫功能，進(jìn)而減少不良反應(yīng)，對(duì)改善DLBCL患者的生存質(zhì)量有積極作用。

綜上所述，經(jīng)受化療的DLBCL患者免疫功能受到一定程度的抑制，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者的淋巴細(xì)胞亞群分布情況可以及時(shí)觀察到患者體內(nèi)是否存在免疫功能紊亂，可以及時(shí)采取一些合適的干預(yù)手段，淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞分布監(jiān)測(cè)作為一種簡(jiǎn)單易行的臨床檢測(cè)手段希望可以在更多的淋巴瘤患者中得到應(yīng)用，以期更好的評(píng)估患者免疫功能，從而在一定程度上改善患者預(yù)后。