護(hù)肝利濕膏的煎煮工藝研究

吳聲振 鄔素珍 吳向維 鄧麗嫦

1.廣東省佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，廣東佛山 528031；2.廣東省佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，廣東佛山 528031

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）已成為全球最常見的肝病之一，全球約有1/4的成人患有此病，嚴(yán)重型NAFLD可發(fā)展為肝硬化、肝衰竭和肝癌等[1-3]。廣東省佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院中醫(yī)專家經(jīng)多年治療NAFLD患者的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)了護(hù)肝利濕湯方，由白芍、黃柏、白術(shù)、佛手、山藥、薏苡仁、茯苓、柴胡等中藥組成，具有健脾利濕、疏肝降脂等功效。為方便患者攜帶和長期服用，將該方制備成煎膏劑（膏方），該劑型與扶正補(bǔ)虛類中藥的功效相輔相成，近年來在抗衰老及慢性疾病的康復(fù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[4-8]。然而，目前膏方的煎煮方法無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，其中浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)等影響膏方質(zhì)量的重要因素多憑經(jīng)驗(yàn)操作，因此所得膏方的質(zhì)量也因人而異，不利于其推廣使用[9-14]。本研究針對(duì)護(hù)肝利濕膏的煎煮條件進(jìn)行工藝研究，使用高效液相色譜法（HPLC），以方中白芍主要成分芍藥苷及黃柏主要成分小檗堿為指標(biāo)，篩選護(hù)肝利濕膏制備過程中的浸泡時(shí)間、加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)的最佳參數(shù)，為護(hù)肝利濕膏煎煮工藝的制定提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

島津LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；BT25S型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；微壓中藥煎煮機(jī)（北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限公司）；KQ2200E型超聲清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；GZX-9023型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。

1.2 試劑

芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110736-201842），鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：120823-201802），均來自中國食品藥品檢定研究院；水為重蒸水，其他試劑均為色譜純；護(hù)肝利濕膏組方中的白芍、黃柏、白術(shù)、佛手、山藥、薏苡仁、茯苓、柴胡等中藥飲片購自廣州至信藥業(yè)股份有限公司，并經(jīng)佛山市中藥研究會(huì)李滿聯(lián)副主任中藥師鑒定為正品；護(hù)肝利濕膏3批（佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院制備，批號(hào)：1010301、1010302、1010303）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Amethyst C18-H（4.6 mm×200 mm，5 μm）；檢測(cè)波長：230 nm；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（每100毫升加十二烷基磺酸鈉0.1 g）（14∶86）；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱定芍藥苷、鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品適量，加適量甲醇制成含芍藥苷1.504 mg/mL，鹽酸小檗堿1.023 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

供試品溶液的制備：取護(hù)肝利濕膏置烘箱中，待完全干燥后，取出置干燥室冷卻干燥至室溫，得干浸膏。取約1 g干浸膏，精密稱定，放入50 mL容量瓶中，加甲醇定容至50 mL，超聲30 min，再次定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 專屬性試驗(yàn) 按護(hù)肝利濕膏的比例與制備工藝，同法制成不含白芍與黃柏的雙陰性樣品，精密吸取混合對(duì)照品、供試品及陰性樣品溶液各10 μL，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明陰性樣品溶液無干擾，方法專屬性良好（圖1）。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC圖譜

2.1.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，加甲醇溶液稀釋出5個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照溶液，按2.1.1項(xiàng)方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定3次，取峰面積平均值。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程分別如下：芍藥苷：Y=3455.6X+1486.5（r=0.9991），在0.60～15.042 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；鹽酸小檗堿：Y=6053.2X+121.76，在0.41～3.07 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3.3 精密度試驗(yàn) 精密量取同一混合對(duì)照品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算各峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），芍藥苷、鹽酸小檗堿的峰面積RSD分別為0.42%、0.70%，表明儀器精密度良好。

2.1.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法制作供試品溶液，分別于制作后0、2、4、6、8、12 h，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并記錄峰面積。芍藥苷、鹽酸小檗堿的峰面積RSD分別為1.92%、1.43%，顯示供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算含量。芍藥苷、鹽酸小檗堿的平均含量分別為0.99%、0.17%，RSD分別為1.57%、1.55%。

2.1.3.6 加樣回收試驗(yàn) 取同一批樣品各0.5 g，分別加入已知含量的混合對(duì)照品，按2.1.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算各峰面積的RSD。芍藥苷、鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為100.01%、99.7%，RSD分別為3.84%、2.38%，提示該方法回收率良好（表1）。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考文獻(xiàn)[15-16]，按處方比例稱取白芍、黃柏、白術(shù)、佛手、山藥、薏苡仁、茯苓、柴胡等藥材9份，每份100 g，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取首次煎煮浸泡時(shí)間（A）、加水量（B）、煮沸時(shí)間（C）及煎煮次數(shù)（D）為影響因素，以芍藥苷及鹽酸小檗堿含量為指標(biāo)進(jìn)行考察，各因素水平見表2，采用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，正交設(shè)計(jì)及正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 影響因素水平表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表

表4 方差分析

2.3 正交試驗(yàn)分析

由表2可見，影響煎煮效果的因素順序?yàn)镈＞C＞B＞A，即煎煮次數(shù)（D）影響最大，加水量（B）、煮沸時(shí)間（C）次之，首煎浸泡時(shí)間（A）影響最小。故選擇偏差平方和最小的首煎浸泡時(shí)間為誤差項(xiàng)，煎煮次數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明煎煮次數(shù)對(duì)煎煮質(zhì)量影響顯著，且煎煮2次時(shí)綜合評(píng)分均值最高。綜合分析預(yù)測(cè)最佳煎煮工藝為A3B2C2D2，即第一煎煮浸泡時(shí)間為6 h，加水量為飲片質(zhì)量的8倍，每次煎煮60 min，共煎煮2次。考慮到生產(chǎn)效率，選取效果接近，耗時(shí)更短的方案更合理，建議實(shí)際煎煮工藝為A2B2C1D2。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照優(yōu)化后的工藝條件進(jìn)行中試，平行制備3個(gè)供試品，測(cè)定各指標(biāo)成分的含量，含量測(cè)定結(jié)果見表5。芍藥苷平均含量14.98 mg/g，RSD值1.26%；小檗堿平均含量3.30 mg/g，RSD值2.19%。優(yōu)選出的最佳工藝參數(shù)重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件的確定

本研究中分別嘗試乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸（每100毫升添加0.1 g十二烷基磺酸鈉）、乙腈-0.1%磷酸（每100毫升添加0.2 g十二烷基磺酸鈉）等流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用乙腈-0.1%磷酸（每100毫升添加0.1 g十二烷基磺酸鈉）芍藥苷與小檗堿峰型分離度及對(duì)稱性最好。通過嘗試不同波長，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)成分峰面積在230 nm處最高，故在此色譜條件下進(jìn)行。研究曾經(jīng)嘗試測(cè)定黃柏堿的含量，但其含量過低，所得色譜峰面積與檢測(cè)限非常接近，因此不把其納入質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇

出膏率曾經(jīng)是衡量膏方質(zhì)量的主要標(biāo)準(zhǔn)，但越來越多的研究表明，出膏率受藥材質(zhì)地、含糖量、粉碎程度等影響，并非越高越好，人們更傾向于服用更少的藥物來實(shí)現(xiàn)同樣的治療效果[17-19]。護(hù)肝利濕膏以白芍滋陰平肝，以黃柏清熱燥濕，佐以佛手、薏苡仁等健脾利濕，共奏健脾利濕、疏肝降脂之功。因此，本研究以君藥白芍與臣藥黃柏中的芍藥苷與小檗堿的提取率作為膏方的內(nèi)在質(zhì)量控制指標(biāo)。

3.3 優(yōu)選工藝的確定

本研究采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選出護(hù)肝利濕膏的最佳煎煮工藝為：首煎浸泡4 h，加8倍量的水，每次煎煮40 min，共煎煮2次。通過研究發(fā)現(xiàn)，首次浸泡時(shí)間對(duì)煎煮質(zhì)量影響較小，可能與本研究實(shí)驗(yàn)部分投料量較少，藥材在較短時(shí)間內(nèi)即可完全潤透有關(guān)。考慮到大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)藥材體積較大，水分難以滲透，故應(yīng)適當(dāng)延長浸泡時(shí)間，有助于有效成分的溶出。當(dāng)煎煮時(shí)間較長時(shí)或提取次數(shù)到達(dá)3次時(shí)，有效成分下降，說明有效成分熱穩(wěn)定性較差，因此護(hù)肝利濕膏的制備過程應(yīng)盡量縮短加熱時(shí)間。然而傳統(tǒng)膏方濃縮過程一般采用長時(shí)間加熱，膏方中的有效成分容易散失，有礙護(hù)肝利濕膏質(zhì)量的進(jìn)一步提高，需要更深入的研究來解決高溫濃縮帶來的問題。

綜上所述，本研究采用正交設(shè)計(jì)法，利用HPLC對(duì)護(hù)肝利濕方中君藥和臣藥的有效成分進(jìn)行檢測(cè)，探究出護(hù)肝利濕膏最佳的煎煮工藝，為其他組方煎煮成中藥膏方的工藝優(yōu)化研究提供理論依據(jù)。