circZEB1通過競爭性結合hsa-miR-656調控胃癌細胞的增殖和凋亡

劉會締，李彥科，苗鵬，邢承忠

（中國醫科大學附屬第一醫院肛腸外科，沈陽 110001）

胃癌是世界范圍內第五大常見腫瘤，在癌癥相關死亡中排第3位［1］。2015年中國癌癥統計數據顯示，中國平均每年新增胃癌患者679 000例，因胃癌死亡人數達498 000例，僅次于肺癌［2］。因此，探尋胃癌發生、發展的分子機制及有效的治療靶點對改善胃癌患者的預后極為迫切。20世紀90年代，人們發現一類新型具有共價閉合環狀結構并且無多聚腺苷酸尾結構的非編碼RNA，將其命名為環狀RNA（circular RNA，circRNA）［3］。研究［4］發現，circRNA的共價閉合環狀結構能夠耐RNA外切酶和RNAse酶降解，因此與線性mRNA相比，circRNA具有更高的穩定性。此外，越來越多的證據表明circRNA參與癌癥的發生、發展過程，并可能成為癌癥的新型生物標志物和潛在的治療靶點。如circPVT1能夠通過競爭性結合miR-199a-5p抑制膠質瘤的增殖和轉移，有望成為膠質瘤潛在的治療靶點［5］；hsa_circ_0000518通過miR-326/FGFR1軸調控乳腺癌的發展進程，進而成為乳腺癌治療靶標［6］；在肝癌中敲除circHIPK3，能夠通過靶向miR-582-3p/DLX2抑制肝癌的致瘤性［7］。本研究鑒定了一個全新的circRNA——hsacirc_0018084（circZEB1），發現其在多種胃癌細胞系中高表達，并檢測circZEB1在多種胃癌細胞和胃黏膜上皮細胞中的表達情況，探查其在胃癌細胞中的定位，并深入探索其在胃癌發展進程中的生物學功能，為胃癌的臨床治療提供了一個新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

胃癌細胞系HGC-27、SGC-7901、AGS、MGC-823、MKN-45和正常上皮細胞系GES-1購自中國科學院上海生命科學院細胞庫；RPMI 1640培養基、胰酶和PBS購自中國Hyclone公司；胎牛血清、青霉素和鏈霉素混合液購自美國Gibco公司；RNA提取試劑TRIzol和Lipofectamine 2000轉染試劑購自日本Invitrogen公司；RNA反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司。

實時PCR儀（LightCyclerR480Ⅱ）購自瑞士Roche公司）；酶標儀（Model 680）購自美國Bio-Rad；流式細胞儀（FACS calibur）購自美國BD Bioscience。

1.2 細胞培養

所有細胞均使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，在5% CO2、37 ℃、飽和濕度的恒溫培養箱內孵育。每2 d更換1次完全培養基，取處于對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.3 CCK-8增殖實驗

在MGC-803和HGC-27細胞系中轉染si-circZEB1以及陰性對照siRNA，48 h后用1 mL含10%胎牛血清的培養基消化并計數細胞，配制含有8×104個細胞、4 mL的細胞懸液，充分顛倒混勻后，在si-circZEB1組和陰性對照組分別取100 μL細胞懸液接種于96孔板，置于37 ℃、濕度95%、含有5%CO2的孵箱中培養。分別于0、24、48、72和96 h加入10 μL CCK-8試劑，于孵箱中繼續培養1 h后利用酶標儀測定si-circZEB1組和陰性對照組450 nm處的光密度值，計算細胞增殖率。

1.4 細胞周期檢測

在MGC-803和HGC-27細胞系中轉染si-circZEB1和陰性對照siRNA，根據細胞周期檢測試劑盒說明書進行操作，收集并調整處理后的細胞濃度為1×106/mL，取1 mL細胞懸液，PBS洗滌細胞1次，離心去除上清，在細胞中加入體積分數為70%的冷乙醇500 μL固定過夜，計算所需染色工作液體積，每個樣本用500 μL工作液孵育，將RNaseA和碘化丙啶按1∶9比例配制成染色工作液。室溫避光孵育30～60 min，上機檢測。比較si-circZEB1組和陰性對照組處于各個周期的細胞豐度。

1.5 細胞凋亡檢測

在MGC-803和HGC-27細胞系中轉染si-circZEB1和陰性對照siRNA，根據細胞凋亡檢測試劑盒說明書，用不含EDTA胰酶消化收集待處理細胞，PBS洗滌細胞2次，收集5×106個細胞。在50 μL的結合緩沖液中加入5 μL 7-AAD染液，混勻。在上述收集的細胞中加入7-AAD染液，混勻；室溫避光5～15 min。反應后再加入450 μL結合緩沖液混勻。加入1 μL Annexin V-PE混勻，室溫、避光反應5～15 min，在1 h內應用流式細胞儀觀察和檢測。

1.6 RNA提取及反轉錄

分別檢測胃癌細胞系HGC-27、SGC-7901、AGS、MGC-823、MKN-45和正常上皮細胞系GES-1中circZEB1的內源性表達含量。檢測轉染si-circZEB1后的轉染效率。取出待處理細胞，利用TRIzol法提取待處理細胞RNA，根據反轉錄試劑盒說明書配制反應體系，最終合成cDNA于-20 ℃保存。

1.7 實時熒光定量PCR

應用TRIzol試劑盒提取待處理細胞總RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA后，設置反應條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s，共45個循環。以β-actin作為內參，以2-ΔΔCt值表示目的基因的相對表達量。引物序列：β-actin，正向5’-GAGGCGTACAGGGATAGCAC-3’，反向5’-GTCA CCAACTGGGACGACAT-3’；circZEB1，正 向5’-TCC TGCACCAAGAAAGATCTGC-3’，反 向5’-TACAAAA CCTCGCGTTTCGC-3’；ZEB1，正向5’-AGCGAGGTA AAGTTGCGTCT-3’，反向5’-AGGTTTTCTGGGCCAT ACCG-3’。

1.8 細胞核質分離純化實驗

在胃癌細胞系MGC-803中檢測內源性circZEB1的核質表達豐度。根據細胞核質分離純化試劑盒說明書，利用1 mL PBS吹刮下細胞并收集到1.5 mL去酶離心管中，4 ℃、600g離心5 min收集細胞。加入300 μL細胞核質分離反沖液，吹勻懸液，冰上放置5 min，1 200g離心5 min，取上清于新管中，4 ℃、500g離心5 min去除雜質，獲得純化細胞質。沉淀部分加入300 μL沖洗液，4 ℃、1 200g離心5 min，取上清，重復一遍，加入300 μL細胞核質分離反沖液重懸細胞核，獲得純化細胞核，接下來利用TRIzol法提取細胞核質分離純化的RNA。

1.9 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。所有實驗均獨立重復3次以上。數據以表示。2組比較采用獨立樣本t檢驗；多組比較采用方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circZEB1的特征

circZEB1共有66 132個堿基，由位于10號染色體上的ZEB1基因的內含子反向剪接而成，故將其命名為circZEB1。在MGC-803細胞系中利用細胞核質分離實驗檢測circZEB1在細胞中的定位情況，發現circZEB1主要表達在細胞質中（圖1A）。在HGC-27、AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN-45以及GES-1細胞系中檢測circZEB1的表達水平，發現其在胃癌細胞系中顯著高表達（圖1B）。

圖1 circZEB1在胃癌細胞系中的表達和定位Fig.1 Expression and localization of circZEB1 in gastric cancer cells

2.2 沉默circZEB1抑制胃癌細胞增殖

在MGC-803和HGC-27細胞系中轉入si-circZEB1，并利用實時PCR檢測轉染效率，結果顯示，2種細胞系均能夠顯著沉默circZEB1的表達（圖2A）。進一步利用CCK-8實驗檢測circZEB1對胃癌細胞增殖能力的影響，結果顯示，與對照組相比，敲除circZEB1后能夠顯著抑制胃癌細胞的增殖能力（圖2B）。

圖2 敲除circZEB1抑制胃癌細胞增殖Fig.2 circZEB1 knockout inhibits the proliferation of gastric cancer cells

2.3 沉默circZEB1促進胃癌細胞凋亡并誘導細胞周期阻滯

鑒于沉默circZEB1能夠抑制胃癌細胞的增殖能力，進一步在MGC-803和HGC-27細胞系中檢測circZEB1對胃癌細胞凋亡和細胞周期分布的影響。流式細胞術結果顯示，沉默circZEB1能夠促進胃癌細胞凋亡并誘導細胞周期阻滯于G0/G1期（圖3）。這在一定程度上解釋了敲除circZEB1對胃癌細胞增殖能力的抑制作用。

圖3 敲減circZEB1促進胃癌細胞凋亡并誘導細胞周期阻滯Fig.3 circZEB1 knockdown promotes apoptosis and induces cell cycle arrest in gastric cancer cells

2.4 circZEB1通過競爭性結合hsa-miR-656調控胃癌細胞增殖和凋亡

通過circRNA靶miRNA預測網站Circular RNA Interactome（https：//circinteractome.irp.nia.nih.gov）發現，circZEB1可能競爭性結合hsa-miR-656。實時PCR進一步發現，沉默circZEB1后hsa-miR-656的表達顯著上調（圖4A）。進一步在胃癌MGC-803細胞系中利用熒光素酶基因報告實驗驗證circZEB1和hsamiR-656的直接靶向關系（圖4B）。由此提出假設，circZEB1可能通過競爭性結合hsa-miR-656調控胃癌細胞的增殖和凋亡能力。

圖4 實時定量PCR和熒光素酶實驗證實circZEB1和hsa_miR-656具有直接靶向關系Fig.4 Real-time quantitative PCR and luciferase reporter assay confirm the direct physical interaction between circZEB1 and hsamiR-656

3 討論

迄今為止，胃癌在世界范圍內的發病率和病死率仍高居不下，尤以我國為重。雖然近年來人們探索胃癌治療方案的腳步從未停止，但治療效果始終不甚顯著，胃癌患者的5年生存率仍低于30%［8］。因此，進一步深入探索胃癌的發生和發展機制以及尋找新的胃癌預測分子標志物意義重大。circRNA是近年新發現的一類具有共價閉合環狀結構的RNA。與傳統線性mRNA相比，circRNA沒有5’末端帽子和3’末端poly尾巴結構，其獨有的共價閉合環狀結構使其具有更強的抗消化作用和更高的穩定性。因此，circRNA被認為具有更高的研究潛能。

目前，人們發現circRNA能夠參與多種腫瘤的發展進程。如circFNDC3B能夠在結直腸癌中競爭性結合miR-937-5p，調控TIMP3的表達，從而抑制結直腸癌的發展進程［9］；circ0000144能夠通過miR-217/AKT3信號通路，促進甲狀腺癌的進展［10］；胰腺癌中，hsa_circ_001587能夠通過海綿miR-223上調SLC4A4的表達，從而抑制胰腺癌細胞的遷移、侵襲和血管生成，成為胰腺癌治療的潛在靶點［11］；circ0079593在黑色素瘤中高表達，并能夠通過miR-516b/GRM3軸促進黑色素瘤的增殖、轉移和糖代謝并抑制其凋亡［12］。

本研究鑒定了一個全新的circRNA——circZEB1。hsa_circ-0018084是由位于10號染色體上的ZEB1基因內含子首尾剪接而成，其成熟序列共有66 132個堿基。利用細胞核質分離實驗檢測其在細胞內的定位情況，發現其主要表達在細胞質中，這暗示其更有可能通過競爭性結合miRNA發揮作用。此外，本研究在多種胃癌細胞系和胃生理上皮細胞系中檢測了circZEB1的表達情況，結果表明，與生理細胞系相比，其在胃癌細胞系中表達顯著上調，提示circZEB1在胃癌的發展進程中更有可能發揮促癌作用。因此，本研究接下來檢測了其對胃癌細胞生物學功能的影響。在MGC-803和HGC-27細胞系中敲除circZEB1后，與對照組相比，敲除circZEB1能顯著抑制胃癌細胞的增殖；流式細胞術結果也顯示，敲除circZEB1能夠促進胃癌細胞的凋亡；并且細胞周期結果表明，沉默circZEB1能夠將胃癌細胞周期阻滯于G0/G1，這在一定程度上也解釋了circZEB1對胃癌細胞增殖能力的作用。鑒于circZEB1主要表達在細胞質，由此推測該circRNA更有可能通過海綿miRNA發揮功能。利用Circular RNA Interactome在線預測網站，本研究發現circZEB1最有可能競爭性結合hsa-miR-656，進一步利用實時PCR檢測，發現敲除circZEB1后hsa-miR-656表達顯著上調，并且熒光素酶報告基因實驗證實了circZEB1與hsa-miR-656的直接靶向關系。由此做出假設，circZEB1可能通過競爭性結合hsa-miR-656，進而調控胃癌細胞的增殖和凋亡。

綜上所述，circZEB1主要表達在胃癌細胞胞質中，在胃癌細胞系中顯著上調，并通過競爭性結合hsa-miR-656調控胃癌細胞的增殖、凋亡和周期分布，影響胃癌發展進程。因此，circZEB1有望成為胃癌治療的潛在治療靶點。