LysM結構域1基因甲基化在膠質母細胞瘤中的臨床意義

呂洪濤，李俊，孫錫同

（大連醫科大學附屬第一醫院 1.神經外科；2.急診科，遼寧 大連 116011）

膠質瘤是中樞神經系統中最具侵襲性和致死性的腫瘤，以高復發率和高死亡率為顯著特征［1］。盡管許多學者付出了巨大努力，但在膠質瘤治療方面幾乎沒有取得進展［2］。膠質母細胞瘤是惡性程度最高的顱內惡性腫瘤，屬于Ⅳ級惡性膠質瘤，是僅次于腦膜瘤的第二常見中樞神經系統腫瘤，同時也是侵襲性最高的顱內惡性腫瘤［3］。在無任何治療情況下，膠質母細胞瘤患者中位生存時間僅為3個月［4］。因此，研究膠質母細胞瘤的潛在生物標志物并為疾病的診斷和治療提供新的見解至關重要。過去的十年中，表觀遺傳修飾尤其是DNA甲基化，已成為癌癥研究的重點。DNA甲基化的變化可能會影響基因表達和反饋機制，并產生各種促進或抑制腫瘤的作用［5］。目前，研究已經報道多種甲基化基因生物標志物，如MGMT啟動子甲基化是膠質瘤預后的主要生物標志物［6］，并可預測膠質母細胞瘤患者對替莫唑胺治療的反應性［7］。本研究利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和UCSC Xena數據庫中膠質母細胞瘤患者的相關數據，對復發與無復發膠質母細胞瘤組織的基因甲基化差異程度進行分析，篩選出具有差異甲基化的基因，并進一步探討該基因能否成為新的膠質母細胞瘤預后標志物，為膠質母細胞瘤的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人膠質瘤細胞系U373，購自中國科學院上海細胞所。

1.1.2 主要試劑：高糖DMEM 培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）；TRIzol試劑、Lipofecamine 2000、LYSMD1cDNA和陰性對照（美國Invitrogen公司）；PrimeScript逆轉錄試劑盒、SYBR PCR Master Mix（寶生物工程有限公司）；MTT試劑（美國Sigma公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和轉染：細胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基，于5% CO2、37 ℃培養箱內培養和傳代。按Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明操作進行cDNA轉染，誘導LYSMD1過表達。

1.2.2 Western blotting：將U373細胞分為轉染LYSMD1cDNA的LYSMD1過表達組和不加任何處理因素的陰性對照組。2組細胞均在培養48 h后，裂解并提取蛋白，進行Western blotting，檢測目的蛋白的表達。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖：將U373細胞分為轉染LYSMD1cDNA的LYSMD1過表達組和不加任何處理因素的陰性對照組。細胞鋪96孔板，5×103/孔，培養24、48、72、96 h后，培養前加入MTT（5 mg/mL），隨后溶于DMSO（100 μL/孔），酶標儀檢測各孔吸光度值（490 nm波長），實驗重復3次。

1.3 生物信息學分析

通 過TCGA（http：//cancergenome.nih.gov）數 據庫下載膠質母細胞瘤患者的轉錄組RNA-seq數據和臨床數據，包含160例膠質母細胞瘤組織樣本。排除2例無復發生存期（recurrence-free survival，RFS）為0的患者樣本，共158例膠質母細胞瘤樣本納入分析。根據有無復發，將158例膠質母細胞瘤患者分為復發組（n=93）和無復發組（n=65）。通過UCSC Xena（https：//xenabrowser.net/datapages）數據庫下載膠質母細胞瘤患者的DNA甲基化數據，共158例膠質母細胞瘤樣本納入DNA甲基化分析。

每個檢測的CpG位點的甲基化水平均由β值表示，β值是一組0～1范圍的連續變量，0代表完全未甲基化，1代表完全甲基化，β值分布符合非對稱雙峰分布。RNA-seq原始數據集用R語言“edgeR”軟件包進行數據處理，對原始數據進行背景校正、標準化。DNA甲基化數據用于差異甲基化分析。比較復發組和無復發組，鑒定出差異甲基化的CpG位點。錯誤發現率（false discovery rate，FDR）＜0.05為差異有統計學意義。

將差異基因投入到單因素、多因素Cox回歸分析中，并將臨床病理參數（年齡、種族、性別、腫瘤狀態）作為協變量進行分析，篩選出與膠質母細胞瘤患者RFS相關的獨立預后基因。

1.4 統計學分析

采用GraphPad 7.0和SPSS 19.0軟件進行統計分析。生存分析采用Kaplan-Meier法并用log-rank進行檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 初步篩選出23個差異甲基化的CpG位點

從UCSC Xena數據庫中下載膠質母細胞瘤患者的DNA甲基化數據，共獲得485 578個CpG位點。通過對復發組和無復發組進行比較，篩選出23個差異甲基化的CpG位點。與無復發組相比，復發組中9個CpG位點甲基化程度顯著下調，14個CpG位點甲基化程度顯著上調。見圖1、表1。

表1 復發組和無復發組中CpG位點的差異甲基化情況Tab.1 Differential methylation of CpG sites in the recurrent and non-recurrent glioblastoma groups

圖1 初步篩選出23個差異甲基化的CpG位點Fig.1 Twenty-three CpG sites with differential methylation were preliminarily screened

2.2 差異甲基化的LYSMD1基因表達水平與膠質母細胞瘤患者預后相關

進一步分析發現，23個差異甲基化的CpG位點對應20個基因（表2）。分別比較這20個基因在復發組和無復發組的差異表達情況。結果顯示，在這20個基因中，僅LYSMD1基因的表達在復發組和無復發組間存在統計學差異（P=0.024 9，圖2A、表2）。與復發組相比，無復發組LYSMD1基因顯著高表達，這與前面分析的復發組LYSMD1基因的CpG位點甲基化程度顯著上調這一結果相符。見表1、表2。

表2 復發組和無復發組中差異甲基化基因的表達情況Tab.2 Expression of differentially methylated genes in the recurrent and non-recurrent glioblastoma groups

利用Kaplan-Meier生存曲線，進一步分析LYSMD1基因的表達水平和膠質母細胞瘤患者RFS之間的相關性。結果顯示，LYSMD1基因的表達水平與膠質母細胞瘤患者RFS顯著相關，LYSMD1高表達與膠質母細胞瘤患者較長RFS相關（P=0.031 3，圖2B）。將LYSMD1基因和臨床病理參數（年齡、種族、性別、腫瘤狀態）投入到單因素Cox回歸分析中，結果發現，LYSMD1基 因（HR=0.627，95%CI：0.413～0.950，P=0.028）和腫瘤狀態（HR=3.467，95%CI：1.735～6.924，P＜ 0.000 1）與膠質母細胞瘤患者RFS顯著相關（圖2C）。多因素Cox回歸分析結果提示，LYSMD1基因（HR=0.583，95%CI：0.384～0.886，P=0.012）和腫瘤狀態（HR=3.658，95%CI：1.827～7.319，P＜ 0.000 1）具有獨立預測膠質母細胞瘤患者RFS的潛在作用，LYSMD1低表達提示膠質母細胞瘤患者具有高復發風險（圖2D）。

2.3 誘導膠質瘤細胞中LYSMD1表達后細胞增殖減慢

上述結果提示LYSMD1在膠質母細胞瘤中可能發揮抑癌基因作用，進一步通過細胞實驗進行驗證，將LYSMD1cDNA轉染至U373細胞，通過Western blotting結果發現，與陰性對照組比較，細胞轉染LYSMD1cDNA后，LYSMD1表達明顯降低（圖3），即有效誘導細胞中LYSMD1高表達。接下來通過MTT法檢測細胞增殖水平的改變，結果發現，LYSMD1基因過表達可使U373細胞增殖活性減弱（圖4），提示LYSMD1可能通過調控細胞增殖活性發揮抑癌作用。

圖4 LYSMD1過表達對膠質瘤細胞增殖的影響Fig.4 Effect of LYSMD1 overexpression on the proliferation of glioma cells

3 討論

膠質母細胞瘤是一種預后不良的腦腫瘤，盡管目前臨床存在多種膠質瘤治療方法，但其復發率仍居高不下，復發率高是膠質母細胞瘤患者預后不良的重要原因［1］。研究［8］證明，DNA甲基化通過調節基因表達影響患者生存。癌基因或抗癌基因甲基化程度過高或過低對不同類型腫瘤的發生和發展有重大影響［9-11］。目前，已有研究［12-16］報道了多種甲基化基因生物標志物。

本研究根據膠質母細胞瘤患者有無復發，將患者分為復發組和無復發組，初步篩選出23個差異甲基化的CpG位點，對應20個基因。進一步分析發現，在這20個基因中，僅LYSMD1基因的表達在復發組和無復發組間存在統計學差異。與復發組相比，無復發組LYSMD1基因顯著高表達，這與復發組LYSMD1基因的CpG位點甲基化程度顯著上調這一結果一致。Kaplan-Meier生存曲線結果提示，LYSMD1高表達患者的RFS較LYSMD1低表達患者明顯延長。單因素、多因素Cox回歸分析結果提示，LYSMD1和腫瘤狀態是膠質母細胞瘤患者RFS的獨立預后因素。

到目前為止，關于LYSMD1基因在腫瘤中的作用未見報道，本研究首次提出其可能作為膠質母細胞瘤標志物，影響膠質母細胞瘤細胞增殖。LYSMD1在膠質母細胞瘤中發揮作用的具體分子機制如何，將在今后的研究中深入開展。

綜上所述，具有差異甲基化的LYSMD1基因與膠質母細胞瘤患者預后相關，可能成為膠質母細胞瘤預后分析的新指標，為今后對膠質母細胞瘤的基礎研究和臨床輔助治療提供參考。但本研究僅基于生物信息學分析，未來需要更大樣本的同類數據進行驗證，同時開展相關的臨床和基礎研究，以確認這些指標的穩定性和實用性。