不同來源乳酸菌核苷降解能力研究

王垚，李文靜，魯茂林，張臣臣，馬文龍，顧瑞霞

（揚州大學江蘇乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇揚州 225127）

0 引 言

體內(nèi)核苷代謝紊亂導致尿酸產(chǎn)生過多或尿酸排泄減少時，容易引發(fā)高尿酸血癥（Hyperuricemia，HUA），嚴重影響人們健康和生活質(zhì)量[1-3]。通過嚴格的飲食控制，減少富含核苷類食物的攝入，是治療高尿酸血癥的一種方法；也可以通過別嘌呤醇或非布索坦等西藥，抑制尿酸合成途徑中關鍵酶黃嘌呤氧化酶的活性，達到降尿酸的目的。但是由于嚴格的飲食控制，降低患者生活質(zhì)量，難以長期堅持，不能達到預期的效果[4-5]；別嘌呤醇等西藥雖然療效好，但存在較大的副作用，在臨床治療上的應用受到一定限制；因此，探索安全、有效的降尿酸方案十分必要[6]。

乳酸菌作為腸道固有有益菌群，在食品、保健品和藥品等領域有著廣泛的應用，乳酸菌能夠水解、吸收食物中的核苷類物質(zhì)，調(diào)節(jié)腸道菌群，從而減少尿酸的合成，在治療高尿酸血癥上具有藥物治療無可比擬的優(yōu)點[7-9]。近年來國內(nèi)外對益生乳酸菌在輔助治療HUA方面的研究越來越多，如日本明治乳業(yè)株式會社的研究表明，格氏乳桿菌PA-3能夠胞外降解核苷，吸收核苷進入胞內(nèi)，降低腸道對核苷類物質(zhì)的吸收，達到降低血尿酸的效果[10-12]。但縱觀目前國內(nèi)關于降尿酸乳酸菌的研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)研究與日本等國差距較大，獲得高效降解能力菌株也十分有限，產(chǎn)業(yè)化更是空白，因此加大對具備降尿酸功能乳酸菌的研究，具有較大應用價值。發(fā)酵食品和人體腸道是常見乳酸菌的兩種主要來源，發(fā)酵食品源乳酸菌種類豐富，人源乳酸菌安全性相對較高，是當今乳酸菌主要的研究方向和重點。由于嬰兒與老人攝入的食物結(jié)構(gòu)存在較大差異，其體內(nèi)的人源乳酸菌的種屬和功能特性也有區(qū)別。因此本研究從核苷降解率和核苷降解速率兩個方面，考察了健康嬰兒腸道、健康長壽老人腸道和傳統(tǒng)發(fā)酵食品三種不同來源的共172株乳酸菌的核苷降解能力，并對其核苷降解能力之間的差異進行分析，以期為后續(xù)篩選出核苷降解能力強、具備緩解高尿酸血癥的益生乳酸菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

本研究所用到的172株乳酸菌均由江蘇省乳品生物技術與安全控制實驗室分離保藏，包含健康嬰兒腸道來源的乳酸菌73株，健康長壽老人腸道來源的乳酸菌25株，泡菜、辣白菜、腌蘿卜和乳扇等傳統(tǒng)發(fā)酵食品來源的乳酸菌74株。

1.1.2 主要試劑

鳥苷、肌苷、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶均購自Sigma-Aldrich中國貿(mào)易有限公司。實驗中用到的其他有機試劑、無機試劑購自國藥集團。

1.1.3 主要儀器

PL2002（1/100）分析天平，Mettler Toledo；JF-SX-500全自動滅菌鍋，TIMY；Millipore Direct 8超純水儀，Millipore；ZHJH-C1209B超凈工作臺，蘇州凈化設備；SPX-150BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械；5804R高速冷凍離心機，Eppendorf；1260 Infinity高效液相色譜儀，Agilent。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

鳥苷-肌苷-黃嘌呤-次黃嘌呤（Guanosine-Inosine-Xanthine-Hypoxanthine，GS-IS-X-HX）標準品溶液：準確稱取0.025 g鳥苷、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤，用20 mmol/L的KH2PO4溶液（pH 7.0）定容至50 mL，配制成GS-IS-X-HX母液，梯度稀釋得濃度分別為0.5、0.2、0.05、0.02、0.005、0.002 g/L的混合標準品溶液。

鳥嘌呤（Guanine）標準品溶液：由于常溫下0.025 g鳥嘌呤在50 mL的KH2PO4溶液（pH 7.0）中無法完全溶解，故配制鳥嘌呤標準品溶液時，稱取0.0125 g鳥嘌呤，用20 mmol/L的KH2PO4溶液（pH 7.0）定容至50 mL，配制成鳥嘌呤母液，梯度稀釋得濃度分別為0.25、0.1、0.025、0.01、0.0025、0.001 g/L的鳥嘌呤標準品溶液。

鳥苷-肌苷（Guanosine-Inosine，GS-IS）緩沖液：準確稱取鳥苷0.02 g、肌苷0.02 g，用20 mmol/L KH2PO4溶液（pH 7.0）定容至100 mL并調(diào)節(jié)pH至7.0，最終緩沖液中鳥苷濃度為0.2 g/L（0.706 mmol/L），肌苷濃度為0.2 g/L（0.746 mmol/L）。

反應終止劑：0.1 mol/L高氯酸溶液，取571μL HClO4（70%），用超純水定容至100 mL。

1.2.2 菌株活化

將待試菌株在平板上劃線分離單菌落，挑單菌落接種至5 mL液體MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24 h，作為活化一代菌株；再將一代菌株以4%接種量轉(zhuǎn)接至5 mL液體MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，作為活化二代菌株，取活化二代菌株用于后續(xù)試驗。

1.2.3 核苷和嘌呤測定方法優(yōu)化

鳥苷、肌苷、鳥嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤的含量采用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatograph，HPLC）法檢測，并對檢測方法進行優(yōu)化[10]；通過外標法確定標準品的保留時間，繪制標準曲線。所用液相色譜儀為Agilent 1260，流動相為等梯度20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 3.0），流動相優(yōu)化的過程中分別添加了1%、3%、5%和10%的甲醇，流速為1 mL/min，柱溫25°C，次黃嘌呤、黃嘌呤、肌苷、鳥苷的檢測波長為254 nm，腺嘌呤為263 nm，鳥嘌呤為273 nm，色譜柱優(yōu)化過程中選擇了ZORBAX SB-C18、Dubhe-C18和Chrom Core Polar C18。

1.2.4 核苷降解率的測定

采用磷酸鹽緩沖液體系評價不同乳酸菌對鳥苷和肌苷的降解率[13]。取適量活化二代菌培養(yǎng)液，室溫4 500 r/min離心3 min，棄上清，收集菌體，菌體用無菌生理鹽水（0.9%NaCl溶液）洗滌2次，向清洗后的菌體中加入1 mL GS-IS緩沖液，混合均勻，控制緩沖液中菌濃OD600為1.5，37℃靜置孵育4 h。孵育后，取1 mL菌液，于4℃，4 500 r/min離心3 min，取上清810μL，加入90μL反應終止劑0.1 mol/L高氯酸溶液，混合均勻后4 500 r/min離心3 min，取上清液使用0.22μL水相濾膜過濾后用于HPLC檢測，分析反應液中鳥苷和肌苷的減少量，以及鳥嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤的生成量。

1.2.5 核苷降解速率的測定

采用磷酸鹽緩沖液體系考察不同乳酸菌對核苷的降解速率[14]。選擇可以完全或者幾乎完全降解鳥苷和肌苷的乳酸菌株56株，在MRS培養(yǎng)基中活化后，取活化二代菌培養(yǎng)液，離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2次，重懸于含0.2 g/L鳥苷的磷酸鹽緩沖液中，每隔30 min取樣檢測分析鳥苷的剩余量。

1.2.6 統(tǒng)計學處理

無特殊說明，相關實驗均進行3次生物學平行，實驗數(shù)據(jù)用分析軟件SPSS進行統(tǒng)計分析，分析結(jié)果用Origin繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 核苷與嘌呤檢測方法優(yōu)化

開展乳酸菌核苷降解能力研究，首先必須建立核苷及其代謝產(chǎn)物嘌呤的檢測方法，常用HPLC測定方法。結(jié)合研究室實際條件和文獻報道[15-16]，本文在安捷倫1260液相色譜儀的基礎上，比較了3種色譜柱對于鳥苷、肌苷及其降解產(chǎn)物的檢測效果，檢測條件及結(jié)果如表1所示，色譜峰如圖1所示。

從表1和圖1A可以看出，反相色譜柱ZORBAX SB-C18不能有效分離鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤和腺嘌呤，反相色譜柱Dubhe-C18不能有效分離腺嘌呤和鳥嘌呤，如圖1B，反相色譜柱ChromCore Polar C18可以較好的分離腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤，其出峰時間分別為6.9、7.9、9.4、12.1 min，如圖1C，而且反相色譜柱ChromCore Polar C18對肌苷和鳥苷的分離度也較好，出峰時間分別為24.4 min和28.7 min，但肌苷和鳥苷出峰時間較長，影響樣品檢測效率；為進一步縮短檢測時間，優(yōu)化了流動相中甲醇含量，以增加反相色譜柱的洗脫能力，如圖1D所示，流動相中添加1%甲醇，可將肌苷和鳥苷的出峰時間提前至17.9 min和21.6 min，繼續(xù)增加甲醇含量至3%、5%和10%（數(shù)據(jù)未列出），僅能略微提前肌苷與鳥苷的出峰時間，且增加檢測成本，因此確定流動相甲醇添加量為1%。

圖1 核苷與嘌呤檢測方法優(yōu)化

表1 不同色譜柱檢測條件及分離效果

經(jīng)優(yōu)化后，選擇反相色譜柱ChromCore Polar C18，以KH2PO4(0.02 mol/L)∶甲醇=99∶1為流動相，經(jīng)等度洗脫，可有效分離腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和鳥苷、肌苷，25 min即可完成一個樣品的定性檢測和定量分析。

2.2 不同來源乳酸菌核苷降解率分析

對從嬰兒腸道、長壽老人腸道和發(fā)酵食品中分離獲得的172株乳酸菌的鳥苷和肌苷降解率進行了測定，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，73株嬰兒腸道源乳酸菌中，94.5%的菌株鳥苷和肌苷降解率低于50%，僅4株菌的鳥苷和肌苷降解率為100%，占比5.5%，如圖2A；25株長壽老人腸道源乳酸菌中，17株乳酸菌鳥苷和肌苷降解率為100%，占比為68.0%，顯著高于嬰兒腸道源乳酸菌中5.5%的比例，如圖2B；在74株傳統(tǒng)發(fā)酵食品來源的乳酸菌中，35株乳酸菌鳥苷和肌苷降解率為100%，占比為47.3%，高于嬰兒腸道源乳酸菌中5.5%的比例，但同樣顯著低于長壽老人腸道源乳酸菌中68%的比例，如圖2C。結(jié)果表明，長壽老人腸道源乳酸菌可以完全降解鳥苷和肌苷的概率大于傳統(tǒng)發(fā)酵食品源和嬰兒腸道源乳酸菌中的概率，更適于篩選核苷降解率高的乳酸菌。

同時，研究過程中發(fā)現(xiàn)3種不同來源的172株乳酸菌的鳥苷和肌苷降解率呈現(xiàn)強正相關性（r=0.989,P＜0.01），如圖2D，即鳥苷降解率高的菌株，其肌苷降解率也高，進而基于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）對不同種屬乳桿菌的核苷代謝途徑進行解析，發(fā)現(xiàn)乳桿菌中催化鳥苷、肌苷、腺苷降解的為同一個酶，嘌呤核苷磷酸化酶（purine-nucleoside phosphorylase，PNP），這從代謝水平上解釋了同一菌株鳥苷降解率和肌苷降解率之間的強正相關關系。雖然本文沒有測定菌株對腺苷的降解率，但基于以上分析，可以推測腺苷降解率和鳥苷、肌苷降解率同樣成正相關關系，鳥苷、肌苷降解率高的菌株，其腺苷降解率也高。由于同一菌株的鳥苷和肌苷降解率呈現(xiàn)強正相關性，所以在考察不同來源菌株的核苷降解速率時，僅選擇以鳥苷降解速率為代表。

圖2 不同來源乳酸菌鳥苷和肌苷降解率分析

2.3 不同來源乳酸菌鳥苷降解速率分析

選擇上述鳥苷和肌苷降解率為100%的56株乳酸菌，活化后重懸于含0.2 g/L鳥苷的磷酸鹽緩沖液中，每隔30 min取樣檢測反應體系中剩余的鳥苷含量，計算鳥苷降解速率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同來源乳酸菌鳥苷降解速率分析

從圖3可以看出，嬰兒腸道來源的4株乳酸菌中，僅1株菌在30 min內(nèi)可以完全降解鳥苷，降解速率大于1.40 mmol/(L·h)，其余3株菌的鳥苷降解速率低于1.1 mmol/(L·h)；長壽老人腸道來源的17株乳酸菌中，鳥苷降解速率大于1.40 mmol/(L·h)的菌株共7株，占比41.2%；發(fā)酵食品來源的35株乳酸菌中，鳥苷降解速率大于1.40 mmol/(L·h)的菌株共7株，占比20.0%；這表明，在可以完全降解鳥苷、肌苷的乳酸菌中，長壽老人腸道源乳酸菌鳥苷降解速率大于1.40 mmol/(L·h)的概率顯著高于嬰兒腸道源乳酸菌和傳統(tǒng)發(fā)酵食品源乳酸菌中相應概率，更適于篩選核苷降解速率快的乳酸菌。

3 結(jié) 論

本文以核苷降解率和核苷降解速率為評價指標，考察了嬰兒腸道、長壽老人腸道和傳統(tǒng)發(fā)酵食品3種不同來源乳酸菌的核苷降解能力，并比較了不同來源菌株核苷降解能力之間的差異。通過研究發(fā)現(xiàn)，（1）長壽老人腸道源乳酸菌中68.0%的菌株可以完全降解鳥苷和肌苷，所占比例最高，顯著高于發(fā)酵食品源（47.3%）和嬰兒腸道源乳酸菌中相應比例（5.5%）；（2）長壽老人腸道源可以完全降解鳥苷和肌苷的乳酸菌中，41.2%的菌株鳥苷降解速率大于1.40 mmol/(L·h)，所占比例同樣顯著高于發(fā)酵食品源（20.0%）和嬰兒腸道源乳酸菌中相應比例（25.0%）；（3）3種不同來源的172株乳酸菌的鳥苷和肌苷降解率呈現(xiàn)強正相關性。這些研究結(jié)果表明，長壽老人腸道源乳酸菌具有較高的核苷降解能力，嬰兒腸道源乳酸菌核苷降解能力普遍較弱，長壽老人腸道源乳酸菌更適宜篩選核苷降解能力強、具備降尿酸潛力的益生乳酸菌，這為篩選可緩解高尿酸血癥的益生乳酸菌提供一定指導。