SPE-HPLC-MS/MS法檢測乳源性運動營養品中5種激素殘留

牛文君

(鄭州澍青醫學高等專科學校，鄭州 450064）

0 引 言

乳源性運動營養品是指以牛乳為主要原料制成的針對運動人群開發的一類補充蛋白質元素的食品[1]，在近些年開始越來越流行。隨著需求量的大增，促使上游養殖環節能夠縮短飼養的周期，提高飼料轉化率等[2-3]，而激素的使用能達到上述的效果。所以畜禽在飼養過程中易受到多種人工激素濫用的影響[4-5]，如雌酮、已烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚和孕酮等，這也導致激素殘留問題影響到消費者的食品安全，因此有必要建立一種檢測含乳源性食品中激素殘留的方法，特別是對運動員這類特殊人群的運動營養品中激素殘留的篩查檢測，評價此類食品的安全具有重要意義。

乳源性食品中檢測激素方法有薄層色譜法、酶聯免疫法、高效液相色譜法以及高效液相色譜-質譜聯用法[6-9]。薄層色譜法對檢測儀器及人員要求較低，但是此方法精度較差、實驗步驟冗長繁多、重現性不好[10]；酶聯免疫吸附試驗法具有靈敏、快速等優點，但是存在交叉污染反應的缺點[11]；高效液相色譜法的檢測穩定性較好，但樣品前處理過程繁瑣，且采用的免疫親和柱成本較昂貴[12]。鑒于上述方法存在的前處理中有些步驟和條件的缺陷，或者易定性誤判等不足，本研究運用SPE前處理凈化技術，簡化提取過程，縮短時間，并依據質譜檢測器具有特異選擇性以及高靈敏度的特性，嘗試建立了SPE凈化技術結合HPLC-MS/MS法檢測乳源性食品中雌酮、已烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚和孕酮5種激素的方法，方法靈敏度高、重現性好，降低了檢測成本、提高了檢測效率，可作為乳源性運動營養品中激素的分析和監控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1200型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；API 3500 QTrap超高壓液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀，美國AB公司；雌酮、已烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚和孕酮標準物質購于德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 樣品來源

樣品均為隨機購買的市售乳源性運動營養品。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

本試驗的色譜柱選用Zorba-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，3μm)；進樣量為2μL；流速為0.15 mL/min；柱溫為30℃；流動相為A：0.20%甲酸溶液，B：乙腈；洗脫條件見表1。

表1 HPLC-MS/MS梯度洗脫條件

1.3.2 樣品的提取與凈化

稱取2.0 g樣品加入20 mL提取溶液，超聲提取10 min，離心后取上清液。取2 mL上清液再進行固相萃取，步驟為：依次用2 mL甲醇和2 mL水活化SPE小柱，然后上樣，再選用5 mL水和5 mL甲醇進行淋洗，最后用5 mL 5%氨水甲醇溶液進行洗脫，收集洗脫液氮氣吹干后用2.0 mL乙腈溶解，過濾膜后上機測定。

1.3.3 標準曲線的建立

吸取10μL的5種激素的標準溶液，用甲醇定容到10.0 mL配制成100.0 ng/mL的中間液，再配制成1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 ng/mL一系列標準溶液，經儀器進行分析，繪制標準曲線。

1.3.4 方法的精密度、重復性與回收率

以未檢出5種激素的乳源性運動營養品為空白基質，加入3個梯度的混合標液，使用SPE小柱提取后，上機檢測計算回收率。

2 結果與分析

2.1 提取溶液的選擇

參考相關文獻[13-15]，5種激素組分屬堿性物質，故選擇中性或者偏酸性溶液提取。本實驗分別比較∶提取溶液Ⅰ（純甲醇溶液）、提取溶液Ⅱ（V甲醇：V水=1∶1、提取溶液Ⅲ（V0.2%甲酸∶V甲醇∶V水=10∶80∶10）、提取溶液Ⅳ（V甲醇∶V0.2%甲酸=90∶10），分別提取加標樣品中的目標物，記錄下目標物峰面積，分析不同類型的提取溶液對激素提取的影響，結果見圖1。

圖1 4種提取溶液對激素回收率的影響

由圖1可知，提取溶液Ⅳ的提取效果整體優于其他3種提取溶液的效果最優，5個目標組分的峰面積最高，這與激素的堿性化合物性質有關，在此比例的偏酸性提取溶液條件下，目標物在提取液中的分配系數高，實現較滿意的提取效果，不同提取溶液間目標組分的峰面積差異顯著(P＜0.05），所以選擇甲醇-0.2%甲酸（體積比90∶10）比較適合進行下一步的實驗方案。

2.2 SPE柱的選擇

由于激素的化學結構中具有含氮堿性中心，其在弱酸或者堿性條件下能離子化成為分子[16]，實驗對比了已經商品化了的HLB、PCX以及MCX 3款固相萃取小柱的做凈化效果對比，記錄下目標物峰面積，分析不同類型的SPE柱對5種激素提取的影響，結果如圖2所示。

圖2 5種激素經不同SPE柱處理后的比較

由圖2可知，MCX小柱回收率最好，5個目標組分的峰面積最高，且不同類型SPE柱間目標組分的峰面積差異顯著(P＜0.05），因此選擇MCX小柱進行固相萃取凈化。且對60 mg/3 mL和150 mg/6 mL兩種規格的MCX小柱進行比較，發現對5種激素都有非常好的保留，回收率沒有明顯差異，從節省成本的角度考慮，60 mg/3 mL小柱更為合適。

2.3 流動相的選擇

在流動相選擇中，比較了純乙腈、乙腈-水（體積比1∶1）、純甲醇、甲醇-水（體積比1∶1）、甲醇-0.1%甲酸（體積比1∶1）和乙腈∶0.20%甲酸（梯度洗脫）作為流動相條件下激素檢測靈敏度及出峰情況。結果發現，流動相中沒有甲酸存在的情況，如：純乙腈、乙腈-水（體積比1∶1）、純甲醇和甲醇-水（體積比1∶1）流動相條件下，5種激素的電離效果較差，出現峰拖尾、峰型對稱性差、靈敏度下降等情況。而選擇乙腈-0.20%甲酸（梯度洗脫）為流動相則得到改善，因此選用乙腈-0.20%甲酸作為流動相。又因運動營養品中基質干擾較大，在流動相條件中設置梯度條件可避免樣品中的基質干擾，使得目標組分的定性和定量更加準確，可以獲得較好的實驗結果（圖3）。

圖3 5種激素的多反應監測（MRM）色譜圖

2.4 質譜條件的選擇

用質量濃度分別為雌酮10.0μg/mL、已烯雌酚0.5μg/mL、雙烯雌酚0.5μg/mL、己烷雌酚0.5μg/mL、孕酮0.1μg/mL的混合標準溶液，對目標物進行一級和二級質譜掃描，并優化質譜參數。5種目標物的質譜分析參數見表2，包括目標物的母離子精確質量數，碎片離子的精確質量數以及去簇電壓和碰撞電壓參數。

表2 5種激素的多反應監測掃描模式的質譜參數

2.5 方法的線性范圍與靈敏度

在乙腈-0.20%甲酸流動相體系中，以表1梯度洗脫的步驟，按1.3.4實驗步驟配制5種激素的標準溶液，繪制標準曲線。結果表明：5種激素在一定線性范圍內均具有良好的線性關系，5種激素的檢出限（LOD）范圍為0.3～6.5μg/kg，定量限（LOQ）范圍為1～20μg/kg，結果見表3。

表3 5種激素的保留時間、標準曲線、相關系數、檢出限與定量限

2.5 方法的精密度、重復性與回收率

在加標回收實驗中，分別選用液態和固態2種基質形態的乳源性運動營養品，分別添加2倍限量、5倍限量和10倍限量低、中、高的三個水平混合標準品，每個結果測定5次，進行加標回收的試驗。

由表4可見，在2種不同的形態基質樣品中，5種激素的加標回收率為82.3%～106%，精密度為2.11%～5.67%，說明本實驗的檢測數據的準確度和精密度可行。

表4 方法的回收率及相對標準偏差(n=5)

3 結 論

本文建立了一種SPE-HPLC-MS/MS檢測乳源性運動營養品中5種激素殘留的分析方法。實驗結果表明，樣品由甲醇-0.2%甲酸（體積比90∶10）進行提取后，經60 mg/3 mL的MCX固相萃取小柱凈化處理后，可有效去除樣品中的干擾物對目標峰的影響，實現對5種激素組分的凈化，在質譜檢測器的多反應監測模式下，可實現同時對樣品中雌酮、已烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚和孕酮5種激素的定性和定量分析。試驗建立的方法加標回收率范圍為82.3%～106%，相對標準偏差在2.11%～5.67%之間，具有可靠的準確度和精密度，能準確快速有效地檢測乳源性食品中的5種激素的含量，可為乳源性運動營養品中雌酮、已烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚和孕酮的分析和監控提供技術支持。