高效液相色譜-原子熒光光譜法分析新疆（南疆）凍干驢乳粉中硒形態含量

郭金喜，范田麗，郭武軍，何曉瑞，周玉貴

(1.新疆維吾爾自治區產品質量監督檢驗研究院國家農副產品質量監督檢驗中心，烏魯木齊 830011；2.烏魯木齊奶業協會，烏魯木齊 830011；3.新疆玉昆侖天然食品有限公司,新疆喀什 844400)

0 引 言

硒(selenium，Se)是人體必需的微量元素之一,具有抗氧化、調控人體血脂代謝、增強免疫力、抗腫瘤、預防心肌病等重要功能,因此被譽為“生命之火”。研究表明硒的功能活性和作用機理與攝入硒的化學形態密切相關[1-3]。硒的形主要有無機硒（硒酸鹽：Se（Ⅵ）、亞硒酸鹽：Se（Ⅳ））和有機硒（硒胱氨酸：SeMet、硒代蛋氨酸：SeCys）兩種，硒的不同化學形態對人體的吸收、生物效應、毒性及防癌作用不同，例如硒酸鹽和亞硒酸鹽等無機硒會導致生物體病變，過多攝入無機硒會引起硒中毒[4-8]，而Se-腺苷-硒半胱氨酸、Se-甲基-硒半胱氨酸、Se-胱硫醚、γ-谷氨酰胺-Se-甲基-硒半胱氨酸等有機硒是人類攝取硒元素的主要來源。新疆驢乳營養價值高，富含蛋白質、脂肪亞油酸、牛磺酸和硒等多種營養物質和微量元素，經檢測驢乳粉中硒含量較高，尤其是南疆（岳普湖縣）驢乳粉硒含量最高，根據查找資料記載南疆驢乳中硒的含量是牛乳的10倍以上[9-14]。目前對乳粉中硒的形態分型的報道很多，但未見對新疆驢乳粉中硒的形態分析未見報道，所以對新疆驢乳粉中硒的形態分型，確定驢乳粉中硒的形態就顯得尤為重要。

硒的形態分型常用的主要有高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用儀（HPLC-ICP-MS）和高效液相色譜-原子熒光光譜聯用儀（HPLC-HG-AFS）[15]兩種分型定量設備，HPLC-ICP-MS具有檢出限低、靈敏度高等優勢，但其儀器原理復雜，使用成本和操作難度高，而原子熒光光譜儀（HG-AFS）是我國少數具有自主知識產權的中高端分析儀器之一，具有結構簡單、分析成本低、靈敏度高、選擇性好和線性范圍寬等優點[16-18]，所以本文采用高效液相色譜-原子熒光光譜聯用儀（HPLC-HG-AFS）對新疆南疆（岳普湖縣）驢乳粉中硒的形態和含量進行分析研究。因為凍干驢乳粉中蛋白質和脂肪含量分別為15.97%～21.60%和9.50%～14.60%，為了能得更好的提取驢乳粉中硒的各種形態，運用蛋白酶和脂肪酶的混合酶共同作用作為酶解提取驢乳粉中硒形態的提取方法。

1 實 驗

1.1 材料及試劑

凍干驢乳粉，購買國產某品牌（南疆岳普湖縣）凍干驢乳粉。

硒單元素標準物質，100 mg/L（GBW 0866）（1%鹽酸溶液介質）；硒代蛋氨酸（SeCys）（GBW 10034），39.4±1.0μg/g（以硒計）、97.9±2.5μg/g（以硒代蛋氨酸計）；硒酸根（Se（Ⅵ））（GBW 10033），41.5±1.3μg/g（以硒計）、75.1±2.4μg/g（以硒酸根計）；亞硒酸根（Se（Ⅳ））（GBW 10032），42.9±0.9μg/g（以硒計）、68.9±1.4μg/g（以亞硒酸根計）；硒代胱氨酸（SeMet）（GBW 10087），44.2±1.0μg/g（以硒計）、93.5±2.5μg/g（以硒代胱氨酸計）；均由中國計量院提供。流動相用5 mmoL檸檬酸+0.5 mmoL四丁基溴化銨（TBAB）+2%CH3OH（調解pH=4.5），現用現配；鹽酸（優級純）、甲醇（優級純），國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.2 儀器設備

HPLC-AFS9800高效液相色譜-雙道原子熒光分光光度計（配有砷-汞空心陰極燈），北京吉天儀器公司；HamiltonPRPX陰離子交換柱（250 mm×4.1 mm、10μm），瑞士漢密爾頓；Agilent M P-C18反相色譜柱（150 mm×4.65 mm、10μm)，美國安捷倫；TOPEX微波消解儀，上海屹堯儀器科技發展有限公司；TS-110X 30恒溫水浴振蕩器，上海捷呈；PHS-3C數字酸度計，上海楚定分析儀器有限公司；GTSONIC-D 6超聲波清洗儀，廣東固特超聲股份有限公司；BSA124S-CW分析天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；SIGAMA3-30K臺式高速型冷凍離心機，德國Sigma。實驗用所有玻璃和聚四氟乙烯器皿均以20%（體積分數）的硝酸浸泡24 h，用去離子水沖洗干凈。

2 方 法

2.1 樣品前處理

2.1.1 總硒提取前處理

由于驢乳粉基體復雜，富含蛋白質和油脂，比常規樣品難消化徹底，未確保最大限度的提取驢乳粉中總硒。本方法減少樣品稱樣量，準確稱取約0.3～0.5 g（精確至0.0001 g）樣品于聚四氟乙烯消解罐中，加入硝酸5.0 mL，混合均勻，放置2 h，于通風廚電熱爐上220℃進行預消化，待硝酸即將剩余0.5 mL左右取下冷卻后補加5 mL硝酸，然后密封好消化管，放入微波消解器，消解完畢后，放入趕酸器種趕酸至約剩0.5 mL，不可蒸干。冷卻后，用去離子水少量多次洗滌定容至25 mL容量瓶中搖勻過0.45μm濾膜及C18小柱凈化備用。同時做空白實驗、樣品加標實驗、空白加標實驗。

2.1.2 硒形態提取前處理

因為新疆南疆（岳普湖縣）凍干驢乳粉中蛋白質和脂肪含量很高，分別為15.97%～21.60%和9.50%～14.60%，為了能得更好的提取驢乳粉中硒的各種形態，采用蛋白酶和脂肪酶的混合酶共同作用讓驢乳粉中蛋白質和脂肪酶解成更易硒形態提取的小分子氨基酸、脂肪酸、酮酸等物質，提高硒形態的提取率。

準確稱取0.3 g（精確至0.0001 g）驢乳粉樣品于15 mL離心管中，加入混5 mL合酶系列4（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均為0.08 g）、pH=7.5、水浴溫度40℃、水浴時間為3 h，對樣品進行恒溫水浴振蕩酶解提取，提取結束于4℃下以10 000 r/min轉速離心5 min。取上層清液定容至25 mL容量瓶中搖勻過0.45μm濾膜及C18小柱凈化備用。同時做空白實驗、樣品加標實驗、空白加標實驗。

2.2 標液配制

標準儲備液配制：準確移取硒單元素標準物質溶液1.00 mL，用體積分數0.5%硝酸（以濃硝酸為基準）稀釋并定容至100.0 mL容量瓶，配制成濃度為1.0 mg/mL標準儲備液；準確稱取SeCys、Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）、SeMet標準物質2.5380、2.4096、2.3310、2.2624 g用超純水溶解分別定容至100 mL容量瓶中，制成1.0 mg/mL標準儲備液。所有標準儲備液冷藏保存，用時逐步稀釋。

Se標準工作液配制：臨用前將Se標準儲備液從冷藏柜種取出，恢復到室溫。將恢復到室溫的標準儲備液分別吸取0、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mL定容至100 mL容量瓶中，配置成各點濃度依次為0.0、10、20.0、40.0、80.0、100.0μg/L標準工作液。

混合標準工作液配置：臨用前將SeCys、Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）、SeMet標準儲備液從冷藏柜種取出，恢復到室溫。將恢復到室溫的標準儲備液分別吸取0、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mL定容至100 mL容量瓶中，配置成各點濃度依次為0、10、20.0、40.0、80.0、100.0μg/L混合標準工作液。

2.3 流動相的選擇

通過前期試驗和查閱資料發現通過運用磷酸氫二銨溶液或者檸檬酸作為流動相時都不能對驢乳粉中硒的形態進行有效分離，磷酸氫二銨溶液作為流動相時不能實現Se（Ⅳ）和SeMet的基線分離，分離效果不好，而采用檸檬酸作為流動相時SeCys和SeMet檢測靈敏度會有所下降。本實驗采用檸檬酸作為流動相的同時添加一定量的四丁基溴化銨（TBAB），可以有效實現SeCys和SeMet的分離和提高檢測靈敏度[19]。本次實驗采用5 mmoL檸檬酸+0.5 mmoL TBAB+2%CH3OH溶液作為流動相（pH=4.5）。

2.4 儀器設備參數

測定總硒的樣品經過微波消解、趕酸、定容后過0.45μm濾膜，進行上機測定。形態分型樣品經過酶提取、離心、定容后過0.45μm濾膜然后上機測定。設備參數見表1,硒形態液相譜圖見圖1。

表1 設備參數條件

圖1 4種硒形態色圖譜

2.5 檢出限及精密度測定

先對空白樣品連續進行21次測定，求出測定值的標準偏差。對樣品中4種形態硒標準系列重復測定3次，取算術平均值后，按線性回歸法求出標準曲線的相關系數。以3倍空白的標準偏差除以標準曲線的斜率，得到檢出限[20]。連續11次重復測標準點濃度為60μg/L的標準溶液，計算RSD值[21]。同事測定空白加標回收率和樣品加標回收率，對樣品4種形態硒進行分型和含量測定。

3 結果與分析

3.1 硒的測定

準確稱取0.3～0.5 g（精確至0.0001 g）驢乳粉樣品采用微波消解，消解好樣品經冷卻定容至15 mL離心管中，過定容后過0.45μm濾膜然后上機測定。采用GB5009.93-2017《食品安全國家標準食品中硒的測定》中第一法（氫化物原子熒光光譜法）對硒含量進行測定。

3.2 酶解提取硒形態參數的確定

準確稱取0.3 g（精確至0.0001 g）驢乳粉樣品于15 mL離心管中，加標后加入10 mL混合酶（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均為0.08 g）、調解pH值、水浴溫度40℃、水浴時間，對樣品進行恒溫水域振蕩酶解提取，提取結束于4℃下以10 000 r/min轉速離心5 min。取上層清液定容至25 mL容量瓶中搖勻過0.45μm濾膜及C18小柱凈化后上機測定。同時做空白實驗、樣品加標、空白加標上機測定。確定酶解提取溫度、酶添加量、時間、pH值4個因素提取樣品中4種形態硒的最佳參數條件。

3.2.1 酶解提取溫度的確定

以提取時間為2 h、提取酸pH值為7、提取用蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均為0.04 g為提取條件，確定提取溫度分別為30、35、40、45、50時，提取凍干驢乳粉4種硒形態的最佳溫度條件。溫度對提取效果的影響，見圖2。

圖2 溫度對4種硒形態提取的影響

由圖2可以看出在提取溫度為40℃時提取效果最好，這表明40℃時酶的活性最好，達到最佳提取效果，溫度過高或過低都會影響酶活性，所以本實驗采用40℃，作為本次實驗的酶解提取溫度。

3.2.2 酶解提取酶濃度的確定

以提取時間為2 h、提取酸pH值為7、提取溫度為40℃，為提取條件，確定提取酶添加量分別為STD1（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.02 g）STD2（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.04 g）、STD3（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.06 g）、STD4（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.08 g）、STD 5（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.1 g）時提取凍干驢乳粉4種硒形態的最佳酶濃度條件。

由圖3可以看出，在酶添加量為STD3（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.06 g）時4種形態硒達到最大值，趨于穩定，說明STD3時酶添加量最為合適，酶解達到飽和狀態，在多就會出現過飽和，造成酶的浪費，過少提取效果不好。所以本次實驗選取酶添加量為STD3作為本次實驗酶添加量。

圖3 酶添加量對4種硒形態提取的影響

3.2.3 酶解提取時間的確定

以提取pH值為7、溫度為40℃、酶添加量為STD3，為提取條件，確定提取時間分別為2、2.5、3、3.5、4 h時提取凍干驢乳粉4種硒形態的最佳時間條件。

由圖4可以看出，提取時間在3 h的4種形態硒的提取達到最大值，過后趨于穩定，說明時間3 h時已經最大限度提取樣品中4中硒形態，無需增加提取時間來增大提取率，所以本次實驗提取時間選取3 h。

圖4 提取時間對4種硒形態提取的影響

3.2.4 酶解提取pH的確定

以提取溫度為40℃、酶添加量為STD3，時間為3 h，為提取條件，確定提取pH值分別為6.5、7、7.5、8、8.5時提取凍干驢乳粉4種硒形態的最佳pH值條件。

由圖5可以看出，在提取pH為7.5時候達到最大值，pH過高或者過低時酶解提取率都會下降，主要原因是選取的酶為弱堿性酶，在酶解pH為7.5的時候效果達到最好，所以每次實驗選取酶解提取pH為7.5。

圖5 提取pH對4種硒形態提取的影響

本次實驗選取酶解提取溫度為40℃、時間3 h、酶添加量STD3、pH為7作為本次實驗的最佳提取條件。

3.3 硒檢測結果

考察硒形態系列標準溶液，在0～100μg/L范圍內其線性實驗結果。對建立4種形態硒標準系列標準曲線，按線性回歸法求出標準曲線的相關系數，對空白溶液、標準溶液進行連續測定，計算準偏差、檢出限、RSD值、加標回收率，對樣品4種形態硒進行分型和含量測定。

3.3.1 硒形態標準曲線

準確稱取SeCys、Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）、SeM et標準物質2.5380、2.4096、2.3310、2.2624 g用超純水分別定容至100 mL容量瓶中，制成1 000μg/kg標準儲備液，冷藏保存。臨用前將4種SeCys、Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）、SeMet標準儲備液從冷藏柜種取出，恢復到室溫。將恢復到室溫的標準儲備液逐步稀釋，配置成各點濃度依次為0.0、10、20.0、40.0、80.0、100.0μg/L混合標準工作液。詳見圖6～7。

圖6 4種硒形態標準系列液相圖譜

圖7 4種硒形態標準系列曲線

3.3.2 線性范圍及檢出限

建立4種硒形態標準曲線，對空白樣品連續進行21次測定，求出測定值的標準偏差。按線性回歸法求出標準曲線的相關系數。以3倍空白的標準偏差除以標準曲線的斜率，得到檢出限。連續11次重復測標準點濃度為60μg/L的標準溶液，計算RSD值。同時測定空白加標回收率和樣品加標回收率，對樣品4種形態硒進行分型和含量測定。結果見表2。

由表2可知，HPLC-HG-AFS測定新疆南疆（岳普湖）凍干驢乳粉中4種硒形態r2在0.9993～0.9998之間、檢出限為0.3μg/kg、定量限為1μg/kg之間、RSD在0.98%～1.03%之間，結果表明本研究方法檢出限、定量限低、精密度，結果穩定，完全滿足檢驗要求。

表2 4種硒形態測定的回歸方程、相關系數、檢出限、定量限、RSD

3.3.3 樣品加標測定結果

按酶解提取的前處理最佳酶解提取溫度為40℃、時間3 h、酶添加量STD3、pH為7作對處理加標實驗樣品。對3組樣品進行加標實驗，用時做空白加標實驗，加標實驗結果見表3。

由表3可以看出3種硒形態Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）樣品加標回收率在88.1%～95.2%之間，而SeCys的樣品加標回收為30.5%～39.4%，不超過40%，但是空白加標四種硒形態回收率在99.5%～101.7%之間結果很好。這是由于該方法提取驢乳粉中SeCys的時候，由于（SeCys）2中的Se-Se化學鍵不穩定，容易斷開且易與乳粉中的蛋白質吸附沉淀。但是Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3種硒形態樣品加標回收率在88.1%～95.2%之間，表明這3種形態硒的分型檢測沒有問題，本實驗運用測定凍干驢乳粉中總硒含量，然后減去測定的Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3種硒形態含量得到SeCys的形態含量。

表3 樣品加標回收結果

3.3.4 硒形態含量測定結果

通過測定樣品中總硒、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）含量，用總硒含量減去Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3種硒形態含量計算出SeCys含量，有機硒含量，詳見表4。

由表4可以看出SeMet含量在10.43～12.79μg/kg之間，占總硒含量的55.1%～77.9%，SeCys含量4.06 μg/kg～7.76μg/kg，占總硒含量的22.1%～39.4%，有機硒（SeM et和SeCys總量）含量在16.68～18.60μg/kg，占總硒含量的94.4%～100.0%。除2#、6#、9#樣品分別含有1.08μg/kg、1.00μg/kg、1.03μg/kg的Se（Ⅵ），其它7個樣品均未檢出無機硒。結果顯示新疆南疆凍干驢乳粉中有機硒含量在16.68～18.60μg/kg之間占總硒在94.4%～100.0%，含有少量或不含有無機硒。

表4 樣品分析結果

4 結果與討論

本實驗通液相色譜-原子熒光光譜（HPLC-HGAFS）聯用儀檢測新疆南疆（岳普湖縣）凍干驢乳粉中硒形態含量，流動相對于分離硒形態有著很大的影響，通過前期實驗和查閱資料發現通過運用磷酸氫二銨溶液或者檸檬酸作為流動相時都不能對驢乳粉中硒的形態進行有效分離，磷酸氫二銨溶液作為流動相時不能實現Se（Ⅳ）和SeMet的基線分離，分離效果不好，而采用檸檬酸作為流動相時SeCys和SeMet檢測靈敏度會有所下降。本實驗采用檸檬酸作為流動相的同時添加一定量的四丁基溴化銨（TBAB），可以有效實現SeCys和SeMet的分離和提高檢測靈敏度。流動相為5 mmoL檸檬酸+0.5 mmoL TBAB+2%CH3OH溶液作為流動相（pH=4.5）。

因為新疆南疆（岳普湖縣）凍干驢乳粉中蛋白質和脂肪含量很高，分別為15.97%～21.60%和9.50%～14.60%，為了能得更好的提取驢乳粉中硒的各種形態，采用蛋白酶和脂肪酶的混合酶共同作用讓驢乳粉中蛋白質和脂肪酶解成更易硒形態提取的小分子氨基酸、脂肪酸、酮酸等物質，提高硒形態的提取率。但是酶法提取對酶的添加量、溫度、pH、時間等提取條件要求很嚴格，所以本方法探討優化了酶法提取驢乳粉中硒形態的參數條件，研究得出結論酶法提取最佳參數條件為溫度40℃、時間3 h、酶添加量STD 3（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.06 g）、pH為7。

凍干驢乳粉中3種硒形態Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）樣品加標回收率在88.1%～95.2%之間，而SeCys的樣品加標回收為30.5%～39.4%，不超過40%，但是空白加標4種硒形態回收率在99.5%～101.7%之間結果很好。這是由于該方法提取驢乳粉中SeCys的時候，由于（SeCys）2中的Se-Se化學鍵不穩定，容易斷開且易與乳粉中的蛋白質吸附沉淀，致使加標回收率下降。但是Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3種硒形態樣品加標回收率在88.1%～95.2%之間，表明這3種形態硒的分型檢測沒有問題，本實驗運用測定凍干驢乳粉中總硒含量，然后減去測定的Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3種硒形態含量得到SeCys的形態含量，很好的計算了新疆南疆（岳普湖縣）凍干驢乳粉中總硒、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）、SeCys含量和占比。

新疆驢乳營養價值高，富含蛋白質、脂肪亞油酸、牛磺酸和硒等多種營養物質和微量元素，經檢測驢乳粉中硒含量較高，尤其是新疆南疆（岳普湖縣）驢乳粉硒含量最高。研究表明硒的功能活性和作用機理與攝入硒的化學形態密切相關。硒的形主要有無機硒有機硒，硒的不同化學形態對人體的吸收、生物效應、毒性及防癌作用不同，無機硒會導致生物體病變，而有機硒是人類攝取硒元素的主要來源，所以過多攝入無機硒會引起硒中毒。本實驗通過HPLC-HG-AFS法測定新疆南疆（岳普湖縣）凍干驢乳粉中硒形態，結果顯示新疆南疆（岳普湖縣）凍干驢乳粉中硒形態中有機硒含量在在16.68～18.60μg/kg之間，占總硒含量的94.4%～100.0%，含有很少或者不含無機硒。研究表明新疆南疆（岳普湖縣）凍干驢乳粉中硒含量豐富且都是人體有益的有機硒。