錫林郭勒牧區鮮馬奶風味物質與微生物多樣性分析

于佳琦，夏亞男，喬曉宏，雙全

（1.內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，呼和浩特 010018；2.阿巴嘎旗照富經貿有限責任公司，內蒙古 錫林郭勒盟 011400）

0 引 言

錫林郭勒地區是蒙古族文化主要發源地之一，馬匹和酸馬奶是其民族文化的重要組成部分[1]。鮮馬奶中營養成分豐富，酪蛋白與乳清蛋白比例適合人體消化吸收[2]。鮮馬奶在生產生活中，一方面被認為是最接近母乳的動物奶源，可作為過敏嬰兒的安全替代食品[3]。另一方面，為酸馬奶產品營造了微生物發酵環境，也為其風味物質合成提供前體物質。目前文獻多是探究鮮馬奶的營養指標和酸馬奶的微生物多樣性[4-5]，較少研究鮮馬奶細菌和真菌多樣性。本文采用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)及高通量測序技術調查錫林郭勒地區鮮馬奶主要風味物質及核心微生物群落組成，全面揭示鮮馬奶的風味物質與微生物多樣性，以期為酸馬奶的風味調控及品質優化和安全保障提供理論依據。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

實驗分析所用鮮馬奶樣本是于2019年6月采自內蒙古自治區錫林郭勒盟阿巴嘎旗牧區的3個平行樣品（命名為XN_1,XN_2,XN_3）。在測定總酸度和pH值后分裝于采樣管，封口并于干冰中轉移至實驗室，冷凍保存用于后續試驗。

乙醚，氯化鈉，無水硫酸鈉等，分析純；3-辛醇（純度≥98%），上海麥克林生化科技有限公司；E.Z.N.A.?soil DNA kit，美國Omega Bio-tek；瓊脂糖，西班牙biowest；FastPfu Polymerase，中國TransGen；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，美國Axygen。

1.2 儀器與設備

FG2-ELK便攜式pH計，METTLER TOLEDO；N-EVAP-45氮吹儀 美國Organomation；Thermo Trace 1300-ISQ氣相色譜-質譜聯用儀；DB-Wax（30m×0.250mm×0.25μm）色譜柱；日立CF16RN冷凍離心機；MX-F固定式漩渦混勻儀，美國SCILOGEX；NanoDrop2000超微量分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；GeneAmp?9700型PCR儀，美國ABI；5424R高速臺式冷凍離心機，美國Eppendorf；Miseq PE300測序儀，美國Illumina。

1.3 方法

1.3.1 鮮馬奶pH值及總酸度測定

在采樣現場通過便攜式pH計測定pH值，滴定酸度參照GB5009.237—2016《食品pH值的測定》中酚酞指示劑法測定。

1.3.2 風味物質測定方法

（1）樣品前處理。參照蘇海榮的方法并稍作改進[6]，取鮮馬奶樣品10 g，加入200μL質量濃度為310 mg/L的3-辛醇內標物，加入氯化鈉至過飽和（有利于香氣物質的萃取）。取溶液于50 mL離心管中，4℃下分別用10 mL和5 mL的乙醚以轉速為5 500 r/min離心5 min萃取2次，合并上層有機相。氮吹濃縮至約0.2 mL，再以乙醚復融定容至2.0 mL，無水Na2SO4干燥，0.22μm有機相膜過濾，供GC/MS上機分析。樣品重復測定3次。

（2）GC-MS檢測條件。色譜條件：參照洪家麗等方法[7]并稍作改進，進樣口溫度250℃；進樣不分流，程序升溫為40℃保持5 min，以3℃/min升溫至200℃，保持5 min，再以2℃/min升溫至230℃，保持10 min。載氣為氦氣，流速1.0 mL/min。

質譜條件：離子化方式：EI；電子能量70 eV;離子源溫度230℃;質量掃描范圍m/z40-500。

（3）定性定量分析。利用Xcalibur工作站NIST譜庫自動檢索各組分質譜數據,并結合保留指數進行定性分析。采用半定量的方法計算各風味化合物的相對含量，根據內標物質(3-辛醇)與各組分峰面積比值計算[8]。

1.3.3 樣品總DNA提取

使用E.Z.N.A.?soil DNA kit試劑盒進行微生物群落總DNA抽提。提取成功后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，并使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度。

1.4 PCR擴增及MiSeq高通量測序

細菌16SrRNA基因V3-V4可變區：上游引物：338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)，下游引物806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。擴增程序：95℃預變性3 min，27個循環（95℃變性30 s，55℃退火30 s,72℃延伸30 s），然后72℃穩定延伸10 min，最后在4℃進行保存。

真菌ITS區PCR擴增：上游引物：ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'），下游引物：ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。擴增程序：95℃預變性3 min，27個循環（95℃變性30 s，55℃退火30 s,72℃延伸45 s），然后72℃穩定延伸10 min，最后在10℃進行保存。

PCR反應體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液4μL，濃度為2.5 mmol/L的d NTPs溶液2μL，上游引物（濃度為5μmol/L）0.8μL，下游引物（濃度為5μmol/L）0.8μL,TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4μL，模板DNA 10 ng，補足至20μL。每個樣本3個重復，將3個重復的PCR產物混合，之后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物[9]。使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit純化PCR產物后用QuantusTMFluorometer進行檢測定量，按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。寄于上海美吉生物醫藥科技有限公司通過Illumina MiseqPE300平臺進行高通量測序。

1.5 數據處理及生物信息學分析

使用Trimmomatic軟件原始測序序列進行質控，使用FLASH軟件進行拼接，質控過濾測序質量低、錯配率高和不能進行拼接的序列，得到優質序列進行分析處理。利用上海美吉公司提供的Sanger生物云信息平臺對測序數據進行細菌多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 鮮馬奶中酸度及風味物質分析

2.1.1 鮮馬奶pH值及滴定酸度

該鮮馬奶樣品中pH值為6.64±0.35，滴定酸度為(14.50±2.94)°T。結果表明鮮馬奶酸度是偏中性，這與前人的檢測結果一致[10]。中性的環境和豐富的營養成分可以為微生物的生長供應更好的條件[11]。

2.1.2 鮮馬奶風味物質分析

采用液液萃取與氣質聯用法（LLE-GC/MS）測定鮮馬奶中風味化合物，總離子流如圖1所示。

圖1 鮮馬奶風味物質總離子流

由圖1可以看出，鮮馬奶的風味物質分離效果較好。在鮮馬奶中共檢測到22種風味物質，包括12種酸類、4種芳香族化合物、3種酯類、2種酮類和1種醇,如表1所示。酸類物質是鮮馬奶的主要風味物質，檢測到的種類及質量分數（（31.15±0.59）μg/g）均最高，其中乙酸、辛酸、癸酸、苯甲酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸和亞麻酸質量分數較高，為鮮馬奶主要的酸類物質。據報道，乙酸具有醋酸味，口感刺激，酸而不澀。而辛酸和癸酸的質量分數越高，越能賦予乳制品更好的奶香品質，對奶香味的貢獻越大[12]?？梢娝犷愇镔|為酸馬奶的刺激口感及奶香味做出了較大貢獻。

表1 鮮馬奶中的風味物質

大多數的酯類物質都具有水果和花香味，對于降低發酵乳中脂肪酸和胺的尖銳、苦澀的味道有幫助[13]。鮮馬奶中總酯質量分數較低（0.26μg/g±0.15μg/g），且僅檢測到14-甲基十五酸甲酯、（Z）-十六烷基十一烯酸甲酯和E-11-十六碳稀酸乙酯3種物質。4種芳香族化合物總質量分數為（5.39±0.11）μg/g，包含苯乙烯、1,3-二叔丁基苯、2,6-二叔丁基對甲酚和2,4-二叔丁基苯酚。酮類物質檢測到2-十五酮和2-羥基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮兩種。鮮馬奶中僅發現十二硫醇一種醇類物質，質量分數為（5.45±0.06）μg/g。通常醇類物質風味閾值較高，因此對發酵乳的風味貢獻度較小[14]。

現有的科學文獻中，鮮有專門針對鮮馬奶中風味物質的研究，較多的是探究酸馬奶及其發酵期間風味物質的差異，且風味物質種類多在35～60種[12,15-16]。鮮馬奶中營養成分豐富，大多作為風味物質的前體物質存在，相比于經過乳酸菌和酵母菌發酵的酸馬奶，其酸類、醇類和酯類物質等種類少，很多大的揮發性分子是通過成熟的過程才能逐漸成為主導[17]。通過LLE-GC/MS法測定鮮馬奶中醛酮類物質數量較其他學者研究結果更少，說明不同地區的樣品以及不同的樣品前處理方法都對試驗結果有很大的影響。目前關于鮮馬奶中風味物質的測定研究較少，該結果可以為探究鮮馬奶風味提供一定的參考。

2.2 鮮馬奶中微生物多樣性分析

2.2.1 細菌和真菌序列的豐度和多樣性

通過Illumina Miseq高通量測序從3個鮮馬奶樣本中共獲得116,045條細菌和171,178條真菌高質量的優化序列，樣本的平均讀數分別為38,682（標準差=5,167）和57,059（標準差=5,009）。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平下的微生物操作分類單元OTU（Operational Taxonomic Units）進行劃分，按最小樣本序列數進行抽平，結果表明所有樣本細菌序列歸屬于5個門，6個綱，10個目，13個科，20個屬，28個種，30個OTU。所有樣本真菌序列歸屬于5個門，17個綱，34個目，54個科，67個屬，84個種，119個OTU。表2是關于樣本信息及α多樣性指數表。

表2 樣本細菌和真菌信息及α多樣性指數

α多樣性是評價微生物群落豐富性和多樣性的指標。Chao1指數和Ace指數用來估算測序樣本中所含OTU個數，反映群落豐富度[18]。本試驗中樣本真菌的平均Chao1指數（56.33±20.60）和Ace指數（61.55±24.39）均顯著高于細菌的Chao1指數（28.33±1.70）和Ace指數（28.86±2.42）。Simpson指數和Shannon指數表征群落多樣性，結果顯示真菌群落多樣性（Simpson指數0.33±0.04；Shannon指數2.03±0.25）高于細菌群落的多樣性（Simpson指數0.25±0.04；Shannon指數1.80±0.09）。以上α多樣性指數表明該批次鮮馬奶樣本真菌物種豐富度和多樣性較高，真菌群落組成較為復雜。將抽平后的細菌和真菌序列作稀釋性曲線，如圖2所示。

圖2 樣本的稀釋性曲線（a,c）和香濃曲線（b,d）

由圖2可以看出，稀釋性曲線趨于平緩，且隨著測序量的增大，實際觀測到的物種數不斷減小，表明測序量的合理性，但真菌稀釋性曲線中第一組樣本的實際觀測到的物種高于其余兩組，說明該組樣本的重復性略差，可能與樣品本身以及測序環境有關。細菌和真菌的香濃曲線達到飽和，結合表中樣本的覆蓋率均大于99.9%，表明該測序結果能充分解釋鮮馬奶樣品的微生物群落信息，僅有很少一部分的微生物群落未被覆蓋到。

2.2.2 鮮馬奶細菌群落組成多形性分析

鮮馬奶細菌門水平和屬水平相對豐度如圖3所示。

圖3 鮮馬奶細菌相對豐度Bar圖

將每個OTU代表序列與Silva數據庫進行比對，所有細菌序列歸屬于5個細菌門，包括厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、藍菌門。鮮馬奶的優勢細菌門為變形菌門，平均相對豐度62.27%，其次為厚壁菌門，平均相對豐度35.46%，兩個細菌門總計占整個酸馬奶樣本的97.73%，而其余未提及到的細菌門相對豐度較低，均在1%以下。

在屬水平上共鑒定出了20個細菌屬。平均相對豐度大于1%的屬共有7個，包括腸桿菌屬(Enterobacter)、勞特菌屬(Raoultella)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和巨型球菌(Macrococcus)，總計占細菌群落的97.73%。鮮馬奶的群落組成中腸桿菌屬為優勢菌屬，相對豐度最高（44.83%），其次為勞特菌屬（17.27%）。趙飛燕等也在鮮馬奶中檢測到了上述細菌，還有一部分芽孢桿菌和氣單胞菌[19]。

鮮馬奶作為一種原料乳，其微生物質量對于確保加工馬乳制品的質量至關重要。據報道，原料乳中一般含有復雜的微生物群，這些微生物的質量與母畜的健康、奶頭表面、飼料、草場環境、擠奶方式和運輸條件等都息息相關[20]。原料乳基質中由于營養豐富及含水量高，為絕大多數的微生物提供了生長的便利條件[21]。鮮馬奶中發現的細菌群落大部分屬于乳酸菌（LAB），如乳球菌屬、乳鏈球菌屬、明串珠菌屬、腸桿菌和腸球菌等。有文獻報道，部分乳酸菌可以將乳制品底物中的可發酵糖類轉化為乳酸、水解酪蛋白、分解脂肪以及進行檸檬酸發酵[22]。而乳酸菌發酵后的酶和代謝產物（如乳酸、芳香族化合物、乙偶姻、游離氨基酸、有機酸、胞外多糖等）在酸馬奶的酸度、口感、香氣和質地方面起重要的貢獻[23]。

鮮馬奶中的優勢細菌屬腸桿菌和腸球菌屬于腸道微生物。有研究表明，它們在傳統發酵食品的風味及感官品質中起著積極作用[24]，能表現出一定的益生菌活性且被應用于生產具有血管緊張素轉化酶抑制活性的發酵乳[25]。但不可忽略的是腸球菌是一種機會病原體，因此，腸桿菌和腸球菌更多的被認為是鮮馬奶中的污染細菌[26]。引起鮮馬奶細菌污染的原因可能有：①病原微生物如乳鏈球菌、大腸桿菌等可能存在于母馬乳腺；②農場衛生條件差，擠奶用具等存在污染；③傳統的人工擠奶方式；④采集樣本季節（包括溫度和濕度）的變化；⑤低溫冷藏促進嗜冷菌的生長并產生耐熱酶，在貯藏過程中水解乳蛋白和脂肪，導致原料乳變性保質期縮短等[27]。

鮮馬奶中的細菌污染可能會導致產品的質地，顏色和風味變差，從而縮短使用壽命，也可能對消費者的健康狀況有所影響，產生嚴重的疾病。因此建議在單獨食用前對其進行加熱處理，盡可能殺滅部分腐敗微生物，提高產品的安全性。在馬乳制品的加工方面，盡量避免鮮馬奶直接自發發酵，建議添加微生物種類質量更優質的引子進行發酵。發酵營造的低pH值環境、乳酸菌競爭性保護作用以及酸馬奶特有微生物產生的抑菌物質等使有害微生物存活率下降，提升發酵馬奶制品品質。

2.2.3 鮮馬奶中真菌群落組成多形性分析

鮮馬奶真菌門水平和屬水平相對豐度如圖4所示。

圖4 鮮馬奶真菌相對豐度Bar圖

真菌也是鮮馬奶中非常重要的一類微生物區系。通過ITS序列，所有真菌被鑒定為主要的兩個門：子囊菌門和擔子菌門，相對豐度分別為27.89%±2.20%和71.12%±3.00%。由圖4可以看出，在鮮馬奶樣本中，擔子菌門為主要的真菌門，其次為子囊菌門。

3個鮮馬奶樣本共鑒定出67個真菌屬，數量明顯高于細菌屬。樣本平均相對豐度大于1%的屬有9個，包括紅酵母屬(Rhodotorula)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)、絲孢酵母菌屬(Trichosporon)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、棒孢酵母屬(Clavispora)、黃曲霉(Aspergillus)、Phialemoniopsis、Saitozyma以及子囊菌門中未被分類的一種菌（unclassified_p_Ascomycota）。紅酵母屬是鮮馬奶的優勢真菌屬，相對豐度55.51%，基于ITS基因高通量測序技術推測它是紅酵母屬中的膠紅酵母種（Rhodotorula mucilaginosa）。

酵母菌對馬奶的風味、質地和營養價值有著重要的促進作用[28]。酵母菌產生的酶分解形成脂肪酸，并進一步發生酯化反應得到具有芳香味的酯類[29]，可以與乳酸菌共同分解蛋白質產生大量的氨基酸[30]等。紅酵母屬廣泛存在于食品中，蘆文娟發現膠紅酵母只存在于原料乳中，而在發酵奶酪中消失[31]。Tahar Amrouche等提到了在駱駝乳中也發現了膠紅酵母屬的存在，且由于其蛋白水解和脂解活性，可以為最終的產品增添風味和香氣[32]。Tezira A等認為膠紅酵母屬在發酵過程中的存在可能不具有功能意義，因為其在乳制品中的存在被認為是腐敗因素，但也可能對風味有一定的影響[33]。此外還發現線黑粉酵母屬的物種可以引起真菌疾?。[球菌?。34]。以上文獻表明，鮮馬奶中優勢菌屬紅酵母屬的存在，為后續發酵中風味的形成奠定了基礎，但其真菌群落組成也表示鮮馬奶存在一定的安全風險。

3 結 論

本研究對錫林郭勒地區鮮馬奶中的風味物質和微生物多樣性進行了測定和分析。鮮馬奶中檢測到的22種風味物質中，酸類物質種類較多，總酸質量分數約為31.15μg/g，主要有乙酸、辛酸、癸酸、苯甲酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸和亞麻酸。4種芳香族化合物總質量分數為（5.39±0.11）μg/g。除此之外還含有少量的醇類物質、酯類物質和酮類物質。微生物多樣性分析結果表明，細菌群落主要包括腸桿菌屬、勞特菌屬、乳球菌屬等，其中腸桿菌屬為優勢細菌屬，相對豐度44.83%。真菌群落主要有紅酵母屬、線黑粉酵母屬、克魯維酵母屬等，其中紅酵母屬為優勢真菌屬，相對豐度55.51%。鮮馬奶中雖然有較高的微生物多樣性，但部分優勢菌是致病菌，存在一定的安全隱患。因此，在加工鮮馬奶時，建議將原料乳進行殺菌消毒處理，或添加具有高質量微生物的引子抑制污染菌的生長，進一步提升馬乳制品的品質。