缺氧誘導食管鱗癌細胞中白細胞介素-7表達促進腫瘤進展

陳 杰，王 嫣，張維敏，趙 笛，張凌瑗，詹啟敏

北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所分子腫瘤學研究室，惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京 100142

食管癌是常見的消化道腫瘤，中國是食管癌高發國家之一，世界上超過50%的食管癌發生在中國［1-3］。現階段中國食管癌患者5年生存率為30.3%。食管癌有兩種主要的病理學類型，分別為食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）。在中國，食管癌的類型主要為ESCC，占95%以上。臨床上治療ESCC的一線化療藥物主要為順鉑，但是其效果不佳，極易出現耐藥。此外，ESCC分子分型不明確，導致很多基于分子靶點開展的靶向治療的效果仍存在爭議。因此，闡明誘導ESCC進展的分子機制將為治療ESCC提供有效的分子靶點。

缺氧是介導實體瘤進展的重要因素［4］。臨床研究［5］顯示，缺氧與腫瘤患者不良預后密切相關。在基礎醫學研究中，缺氧能夠誘導腫瘤細胞代謝改變、上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及腫瘤干細胞形成，使腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移能力增強，并產生放化療抵抗［6-8］。研究［9］發現，缺氧能夠誘導腫瘤細胞自分泌細胞因子，進而促進腫瘤進展。本研究將篩選缺氧誘導ESCC細胞中細胞因子表達譜，并重點研究白細胞介素（interleukin，IL）-7對缺氧情況下ESCC進展的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑與耗材

IL-7中和抗體（貨號：MAB207）及IL-7酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號：HS750）均購自美國R&D公司，細胞因子陣列蛋白芯片（貨號：AAH-CYT-6）及蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）定量ELISA活性檢測試劑盒（貨號：PELAKT-S473-T-1）購自美國RayBiotech公司，MTS檢測試劑盒（貨號：G3580）購自美國Progema公司，RPMI-1640培養基（貨號：A1049101）及胎牛血清（貨號：10099）均購自美國Gibco公司，transwell侵襲小室（貨號：CLS3422）購自美國Corning公司。

1.2 細胞培養

人ESCC細胞系KYSE410和KYSE30均由惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室保存。細胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中培養。常氧培養條件為：37 ℃、CO2體積分數為5%。缺氧培養條件為：37 ℃、N2體積分數為94%、CO2體積分數為5%、O2體積分數為1%。

1.3 細胞因子陣列蛋白芯片檢測細胞因子分泌

將KYSE410細胞分別置于常氧及缺氧條件下培養。24 h后，收集上清液，將1 mL細胞上清液與包被細胞因子抗體的蛋白芯片于4 ℃過夜溫育。之后棄上清液，加入洗液清洗蛋白芯片后，加入辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素（horseradish peroxidase-streptavidin，HRP-SA）室溫溫育2 h后，洗去HRP-SA，加入顯色液曝光顯影。

1.4 MTS法檢測細胞增殖能力

取對數生長期細胞，以每孔3 000個細胞的密度均勻接種于96孔板中，待細胞貼壁后，置于缺氧培養環境并加入磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）及IL-7中和抗體。48 h后，每孔加入10 μL MTS溶液。使用酶標儀測定490 nm波長處每孔的吸光度（D）值。實驗重復5次取平均值。

1.5 侵襲遷移實驗

將KYSE410及KYSE30在不含血清的RPMI-1640培養基中于常氧培養條件下培養。12 h后，收集細胞，以每孔10 000/200 μL的密度接種于覆蓋（侵襲實驗）或不覆蓋基質膠（遷移實驗）的transwell小室的上室，下室中加入1 mL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養基，缺氧培養條件下培養24 h后取出小室，甲醇固定5 min，結晶紫染色30 min后，擦去上室內的細胞。顯微鏡下拍照并計數。實驗重復5次取平均值。

1.6 ELISA法檢測IL-7分泌及AKT活性

在檢測IL-7分泌的過程中，將KYSE410及KYSE30細胞分別置于常氧及缺氧培養條件下。24 h后，收集上清液，將20 μL樣本與80 μL樣本稀釋液混勻后，加入96孔板中，室溫溫育2 h后，洗掉樣本。逐步加入一抗稀釋液、洗脫、加入HRP-SA、洗脫、加入顯色液、置于室溫避光溫育30 min后，加入終止液，混勻后酶標儀檢測D值。實驗重復3次取平均值。

在檢測AKT活性的過程中，將KYSE410及KYSE30細胞分別置于常氧及缺氧培養條件下。24 h后，收集細胞，用裂解液裂解蛋白，將蛋白裂解液（約20 μg/孔）加入96孔板后，按照試劑盒使用說明檢測腫瘤細胞AKT活性（磷酸化AKT Ser473的D值/總AKT的D值）。實驗重復5次取平均值。

1.7 統計學處理

采用GraphPad Prism 7.0版統計軟件進行數據分析。實驗數據均以的形式表示。獨立兩組間比較使用非配對t檢驗。量效關系使用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 缺氧誘導ESCC細胞中細胞因子及趨化因子表達譜改變

缺氧微環境可以誘導腫瘤細胞中細胞因子分泌增強，但是缺氧對ESCC細胞中細胞因子表達的調控仍未可知。為明確缺氧調控ESCC細胞中哪些細胞因子，本研究采用細胞因子陣列蛋白芯片技術分析常氧狀態下ESCC細胞系KYSE410與缺氧狀態下KYSE410中的細胞因子表達譜，發現缺氧處理24 h后，KYSE410細胞分泌多種細胞因子，如IL-10、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-7、單核細胞趨化蛋白2（monocyte chemoattractant protein 2，MCP2）、C-C趨化因子配體（C-C motif chemokine ligand，CCL）5、CCL17、CCL18及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等。這些細胞因子均與腫瘤進展關系密切，參與腫瘤細胞增殖、侵襲轉移、血管新生及免疫細胞對腫瘤細胞的作用。其中，ESCC細胞在缺氧狀態下IL-7的分泌增高最為明顯（圖1）。

圖1 缺氧誘導KYSE410細胞中細胞因子表達譜改變Fig.1 Hypoxia induced the expression profile of cytokines and chemokines of KYSE410 cell

2.2 缺氧誘導ESCC細胞中IL-7分泌增強

進一步研究缺氧是否可以介導ESCC細胞中IL-7分泌增多，以常氧條件培養的KYSE410、KYSE30細胞系為常氧組，缺氧24 h培養的KYSE410、KYSE30細胞系為缺氧組，并通過ELISA法分析兩個細胞系中IL-7的分泌情況。ELISA法實驗結果顯示，缺氧顯著誘導ESCC細胞系中IL-7的分泌。對照組KYSE410細胞IL-7分泌量為（275.70±82.98）pg/mL，實驗組KYSE410細胞IL-7分泌量為（2 451.00±87.90）pg/mL，差異有統計學意義（P＜0.001）；對照組KYSE30細胞IL-7分泌量為（325.80±85.46）pg/mL，實驗組KYSE410細胞IL-7分泌量為（2 653.00±126.70）pg/mL，差異有統計學意義（P＜0.001，圖2）。

圖2 缺氧誘導KYSE410及KYSE30細胞中IL-7分泌增強Fig.2 Hypoxia induced the IL-7 secretion from KYSE410 and KYSE30 cells

2.3 IL-7中和抗體抑制缺氧狀態下ESCC細胞的增殖

在缺氧狀態下（48 h），以PBS為對照，采用不同濃度的IL-7中和抗體（5、10 μg/mL）處理KYSE410及KYSE30細胞。MTS實驗結果顯示，IL-7中和抗體能夠劑量依賴性地抑制ESCC細胞系增殖。對照組KYSE410細胞相對增殖率（與本組比較）為1.000±0.055，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE410細胞組相對增殖率（與對照組比較）為0.610±0.026，差異有統計學意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE410細胞組相對增殖率（與對照組比較）為0.326±0.022，差異有統計學意義（P＜0.001）。對照組KYSE30細胞相對增殖率（與本組比較）為1.000±0.036，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE30細胞組相對增殖率（與對照組比較）為0.673±0.019，差異有統計學意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE30細胞組相對增殖率（與對照組比較）為0.359±0.017，差異有統計學意義（P＜0.001，圖3）。

圖3 IL-7中和抗體抑制缺氧狀態下KYSE410及KYSE30細胞的增殖Fig.3 IL-7 neutralizing antibody inhibited proliferation of KYSE410 and KYSE30 cells under hypoxia

2.4 IL-7中和抗體抑制缺氧狀態下ESCC細胞的侵襲及遷移

Transwell實驗結果顯示，相比對照組，隨著IL-7中和抗體（5、10 μg/mL）濃度的增高，缺氧狀態下，ESCC細胞系KYSE410及KYSE30侵襲及遷移能力顯著降低。侵襲實驗結果顯示，對照組KYSE410細胞相對侵襲率（與本組比較）為1.000±0.117，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE410細胞組相對侵襲率（與對照組比較）為0.388±0.070，差異有統計學意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE410細胞組相對侵襲率（與對照組比較）為0.174±0.025，差異有統計學意義（P＜0.001）。對照組KYSE30細胞相對侵襲率（與本組比較）為1.000±0.090，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE30細胞組相對侵襲率（與對照組比較）為0.433±0.040，差異有統計學意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE30細胞組相對侵襲率（與對照組比較）為0.210±0.037，差異有統計學意義（P＜0.001，圖4A）。遷移實驗結果顯示，對照組KYSE410細胞相對遷移率（與本組比較）為1.000±0.162，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE410細胞組相對遷移率（與對照組比較）為0.450±0.080，差異有統計學意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE410細胞組相對遷移率（與對照組比較）為0.163±0.028，差異有統計學意義（P＜0.001）。對照組KYSE30細胞相對遷移率（與本組比較）為1.000±0.100，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE30細胞組相對遷移率（與對照組比較）為0.272±0.063，差異有統計學意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE30細胞組相對遷移率（與對照組比較）為0.160±0.049，差異有統計學意義（P＜0.001，圖4B）。

圖4 IL-7中和抗體抑制缺氧狀態下KYSE410及KYSE30細胞的侵襲轉移Fig.4 IL-7 antibody inhibited invasion or migration of KYSE410 and KYSE30 cells under hypoxia

2.5 IL-7中和抗體抑制缺氧狀態下ESCC細胞中信號分子AKT的活性

本研究通過ELISA法分析缺氧對ESCC細胞系中AKT活性的影響，結果顯示，缺氧24 h后，ESCC細胞系KYSE410及KYSE30中AKT Ser473活性顯著上調（圖5A）。對照組KYSE410細胞AKT活性為0.454±0.019，實驗組KYSE410細胞AKT活性為0.744±0.047，差異有統計學意義（P＜0.001），對照組KYSE30細胞AKT活性為0.462±0.037，實驗組KYSE30細胞AKT活性為0.809±0.064，差異有統計學意義（P＜0.001，圖5A）。外加IL-7中和抗體能夠有效地抑制KYSE410及KYSE30細胞中AKT Ser473的磷酸化激活（圖5B）。對照組KYSE410細胞AKT活性為0.756±0.058，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE410細胞組AKT活性為0.441±0.038，差異有統計學意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE410細胞組AKT活性為0.214±0.028，差異有統計學意義（P＜0.001）。對照組KYSE30細胞AKT活性為0.815±0.082，IL-7中和抗體（5 μg/mL）處理KYSE30細胞組AKT活性為0.472±0.04，差異有統計學意義（P＜0.001）。IL-7中和抗體（10 μg/mL）處理KYSE30細胞組AKT活性為0.234±0.029，差異有統計學意義（P＜0.001，圖5B）。

圖5 IL-7中和抗體抑制缺氧狀態下KYSE410及KYSE30細胞中AKT活性Fig.5 IL-7 antibody inhibited the AKT activity of KYSE410 and KYSE30 cells under hypoxia

A:Quantitative ELISA assay was used to evaluate theDvalue of pAKT Ser473/theDvalue of total AKT (AKT activity) in KYSE410 and KYSE30 cells under normoxic or hypoxic condition for 24 h.B:Quantitative ELISA assay was applied to examine the AKT activity in KYSE410 and KYSE30 cells treated with PBS (control solvent),or IL-7 antibody (5,10 μg/mL),under hypoxia for 24 h.**:P＜0.001,compared with normoxia;***:P＜0.001,compared with control group

3 討論

本研究顯示，缺氧可誘導ESCC細胞中多種細胞因子及趨化因子的自分泌表達，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-10、MCP2及CCL5等。其中，TNF-α、IL-1β及IL-10是慢性炎癥與腫瘤關聯的重要細胞因子，這些因子的多態性與腫瘤進展關系密切［10］。IL-6能夠通過調控腫瘤細胞可塑性、介導化療耐藥，進而促進腫瘤進展。腫瘤微環境釋放的CCL5，能夠通過作用于腫瘤細胞中相應受體CCR5，介導腫瘤的多種惡性表型［11］。因此，細胞因子的活性增強是調控腫瘤進展的重要因素之一。

本研究重點闡明了IL-7作為缺氧誘導細胞因子，介導ESCC進展及相關分子機制。IL-7能夠產生廣泛免疫效應，在免疫細胞活化過程、產生免疫應答效應、調控自身免疫性疾病及抗纖維化中具有重要作用，是細胞因子研究領域的熱點因子。在腫瘤學領域，IL-7與腫瘤關系復雜。其中，IL-7參與多種免疫細胞對腫瘤生長增殖的調控。在嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）細胞免疫療法中，CAR-T細胞中高表達的IL-7能夠增加免疫細胞在局部實體瘤的浸潤并增強CAR-T細胞的抗癌效應［12］。但是，IL-7的受體IL-7R是一個重要的癌基因，IL-7/IL-7R軸能夠通過調控腫瘤細胞中細胞周期蛋白D1的表達，進而促進腫瘤細胞增殖并抵抗凋亡［13］。在細胞實驗中，加入IL-7重組蛋白能夠通過激活前列腺癌細胞中AKT/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號轉導通路，進而增強基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-3及MMP-9分泌，促進前列腺癌細胞侵襲能力的增強［14］。本研究顯示，缺氧ESCC細胞中自分泌產生的IL-7能夠介導腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移，拮抗IL-7的功能顯示，抑制缺氧狀態下ESCC細胞的增殖、侵襲及轉移，證實IL-7是介導腫瘤細胞在缺氧微環境中進展的重要細胞因子。

研究［15］顯示，細胞因子介導腫瘤進展主要與激活腫瘤細胞中的信號通路有關。IL-6可以通過激活JAK家族激酶/信號轉導與激活轉錄因子通路促進多種腫瘤進展，且此信號軸是腫瘤治療中重要的靶點信號軸。多種細胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-8、MIP2及CCL2等，均與腫瘤細胞中NF-κB信號通路的激活及多種惡性細胞表型的形成密切相關［16］。有研究［17-18］顯示，IL-7能夠通過激活信號通路促進腫瘤進展，如磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/AKT通路及JAK1/Stat5信號轉導通路。AKT是介導ESCC進展最重要的信號分子，本研究結果顯示，拮抗IL-7的功能能夠顯著抑制缺氧條件下ESCC細胞中AKT的活性，但IL-7能否也通過調控其他信號分子，進而誘導ESCC進展仍有待于進一步研究。

本研究通過蛋白芯片技術研究缺氧介導ESCC細胞中細胞因子的表達情況，并研究了IL-7對缺氧促進ESCC進展的影響及相關分子機制，為深入研究缺氧-細胞因子軸介導腫瘤進展提供了新思路。