基于熵權法計算權重系數的正交試驗優化益根調理膏醇提工藝

蔣 林，郭勇秀，李芳嬋，龐曉云，魏博偉，隨家寧

（1.廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530001；2.廣西壯瑤藥工程技術研究中心，南寧 530001；3.廣西中醫藥大學制藥廠，南寧 530001）

益根調理膏是廣西中醫藥大學通過挖掘《本草綱目》溲數遺尿古方演繹出來的民間驗方，由黃精、玉竹、覆盆子、桑葚、補骨脂、益智、韭子、火麻仁、山楂9味藥組成，對治療老年人夜間多尿癥有顯著療效。前期課題組經動物試驗表明，益根調理膏能降低腎陽虛多尿動物的尿量，提高血清中醛固酮，降低BUN水平，對腎有保護作用。中藥多以湯劑為主，湯藥長期服用，脾胃不適，且口感不佳，難以長期服用，臨床使用存在諸多不便。為了增加患者的依從性及便捷作用，擬開發成院內制劑益根調理膏，現針對該方法的提取工藝進行研究。

中藥復方成分復雜，對其提取工藝進行優化及合理選擇評價指標一直是同行研究熱點，比較成熟的優化方法有正交試驗及星點-響應面優化法，評價指標多數以具有與藥效相關及專屬性較強的成分為主，但目前并沒有一個明確的標準。因此本試驗采用正交試驗，以乙醇體積分數、溶劑量、提取時間、提取次數為考察因素，以總黃酮、補骨脂素和圓柚酮提取量為指標，再根據熵權法計算權重系數確定各指標綜合評分，優化益根調理膏醇提工藝，為該制劑后期開發成院內制劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥材

補骨脂素，C12J8Q39802，HPLC≥98%（經面積歸一法測定），上海源葉生物科技有限公司；圓柚酮，4674-50-3，純度以98%計（經面積歸一化法測定），美國Sigma公司；蘆丁，批號170506，供含量測定，純度為＞99%，中國食品藥品研究院。

覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子（Rubus chingiiHu）的干燥果實，批號170801，南寧生源中藥飲片有限責任公司；補骨脂為豆科植物補骨脂（Psoralea corylifolialL.）的干燥成熟果實，批號161101，南寧市萬藥堂藥業有限公司；益智為姜科植物益智（Alpinia oxyphyllaMiq.）的干燥成熟果實，批號170401，南寧市萬藥堂藥業有限公司；韭子為百合科植物韭菜（Allium tuberosumRottl.ex Spreng.）的干燥成熟種子，批號170101，南寧生源中藥飲片有限責任公司；山楂為薔薇科植物山楂（CrataeguspinnatifidaBge.）的干燥成熟果實，批號170404，南寧市萬藥堂藥業有限公司；火麻仁為桑科植物大麻（Cannabis sativaL.）的干燥成熟果實，批號17032301，廣西寶正藥業有限公司。

1.2 儀器

752型紫外可見分光光度儀，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；ME104E電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；SG250HE超聲儀，40 kHz，200 W，上海冠特超聲儀器有限公司；LC-2030C3D高效液相色譜儀，島津企業管理有限公司。

1.3 試劑

甲醇，批號2016121201，分析純，成都市科龍化工試劑廠；甲醇，色譜純，Fisher；氫氧化鈉，分析純，批號1508151，西隴化工股份有限公司；亞硝酸鈉，分析純，批號2017030501，天津博迪化工股份有限公司；硝酸鋁，分析純，批號20170517，天津市大茂化學試劑廠；石油醚，沸程60～90℃，分析純，批號170601，西隴科學股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 評價指標的確立及評價方法 由于中藥復方具有多成分、多靶點作用的特點，不能僅僅以其中某一種成分的含量為評價指標，多成分多指標綜合評價復方的內在質量應是發展的方向。覆盆子、補骨脂、益智、韭子、火麻仁、山楂6味藥均含有黃酮類化合物，是主要功效成分之一，補骨脂、韭子的香豆素類化合物為主要功效成分，益智溫腎縮尿的重要成分是圓柚酮，故選擇以總黃酮、補骨脂素和圓柚酮提取量的綜合評分為益根調理膏醇提工藝的評價指標。

1.4.2 總黃酮測定

1）樣品與供試品制備。樣品：按比例稱取覆盆子、韭子、益智、山楂、火麻仁藥材，加10倍60%乙醇回流提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓旋轉蒸發回收乙醇，濃縮至稠膏，備用。

供試品溶液：取樣品適量（相當于5.8 g生藥量），精密稱定，加水至30 mL，置于分液漏斗中，加石油醚（60～90℃）30 mL，萃取3次，水層蒸干，殘渣加甲醇溶解并過濾，濾液置于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度線，搖勻，即得。

2）標準曲線繪制。取蘆丁適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含蘆丁對照品0.248 3 mg的溶液，即為對照品溶液。精密量取蘆丁對照品溶液（0.248 3 mg∕mL）1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%氫氧化鈉10 mL，加水至刻度線，放置15 min，以相應試劑作空白，于500 nm波長處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，以濃度X為橫坐標，進行回歸分析，結果在9.93～59.60μg∕mL與吸光度呈良好線性關系，回歸方程為A=11.346X-0.001 5（R2=0.999 9）。

3）穩定性試驗。精密量取供試品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，自“加水至6 mL”起，按“標準曲線繪制”方法操作，分別于0、5、10、15、20、30 min測定吸光度，計算RSD。結果RSD為2.03%，表明供試品溶液在30 min內穩定性良好。

4）精密度試驗。精密量取2 mL蘆丁對照品溶液，自“加水至6 mL”起，按“標準曲線繪制”方法操作測定吸光度，連續測定6次，計算RSD。結果RSD為0.94%，表明儀器精密度良好。

5）重復性試驗。取樣品適量（相當于5.8 g生藥量，6份），制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，自“加水至6 mL”起，按“標準曲線繪制”方法操作測定吸光度，計算RSD，結果RSD為1.29%，表明本方法的重現性良好。

6）加樣回收試驗。取樣品適量（相當于2.9 g生藥量，6份），精密加入蘆丁對照品，按“1.4.2”項下方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，自“加水至6 mL”起，按“標準曲線繪制”方法操作測定吸光度，計算加樣回收率。結果平均回收率為99.3%，RSD為0.699%，表明該方法回收率符合要求。

1.4.3 補骨脂素含量測定

1）色譜條件。PHenomenex Gemini C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相乙腈-水（38∶62），流速1 mL∕min，柱溫30℃，檢測波長244 nm，進樣量5μL。

2）補骨脂素對照品溶液。取補骨脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含補骨脂素對照品0.098 5 mg的溶液，備用。

3）供試品溶液制備。取“1.4.2”項下樣品適量（相當于總藥材5.8 g），置于蒸發皿中蒸干，加甲醇溶解，過濾，濾液置于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度線，即得。

4）標準曲線繪制。精密取2、4、6、8、10、12μL補骨脂素對照品溶液，按色譜條件操作，記錄峰面積。以質量為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸。回歸方程為Y=6 810 230X+41 377.0（R2=0.999 9）。結果表明在0.197～1.182μg與峰面積呈良好線性關系。

5）穩定性試驗。取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄峰面積，計算補骨脂素的含量及RSD。結果RSD為0.28%，表明樣品在24 h內穩定性良好。

6）精密度試驗。取補骨脂素對照品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積，計算RSD，RSD為0.05%，表明儀器精密度良好。

7）重復性試驗。取樣品適量（相當于5.8 g生藥量）（6份），制備供試品溶液，進樣測定記錄峰面積，計算補骨脂素的含量，計算RSD。結果RSD為1.42%，表明方法重復性良好。

8）加樣回收試驗。取樣品適量（相當于2.9 g生藥量），共6份，分別精密加入補骨脂素對照品，制備供試品溶液，進樣測定記錄峰面積，計算加樣回收率。結果樣品的平均回收率為100.0%，RSD為0.93%，表明該測定方法符合要求。

1.4.4 圓柚酮含量測定

1）色譜條件。PHenomenex Gemini C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相乙腈-水（56∶44），流速1 mL∕min，柱溫30℃，檢測波長239 nm，進樣量10μL。

2）對照品溶液制備。取圓柚酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.055 mg圓柚酮對照品的溶液。

3）標準曲線繪制。精密吸取4、6、8、10、12、14μL圓柚酮對照品溶液注入高效液相色譜儀中，進樣測定記錄峰面積。以質量為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸。回歸方程為Y=2 094 970X-2 128.11（R2=0.999 9）。表明圓柚酮在0.220～0.770μg與峰面積呈良好線性關系。

4）穩定性試驗。取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄峰面積。結果RSD為1.92%，表明樣品在24 h內穩定性良好。

5）精密度試驗。取圓柚酮對照品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積，計算RSD。結果RSD為0.45%，表明儀器精密度良好。

6）重復性試驗。取樣品適量（相當于5.8 g生藥量，6份），制備供試品溶液，進樣，記錄峰面積，計算RSD。結果RSD為2.02%，表明方法重復性良好。

7）加樣回收試驗。取樣品適量（相當于生藥量2.9 g，6份），精密加入圓柚酮對照品，按供試品溶液制備方法操作，計算加樣回收率。結果平均回收率為101.8%，RSD為1.38%，表明該方法回收率符合要求。

2 結果與分析

根據文獻和預試驗考察結果，影響醇提工藝的主要因素有乙醇體積分數、溶劑量、提取時間及提取次數，根據單因素考察結果，采用正交設計，選擇L（934）正交表，對益根調理膏醇提工藝進行優化，設計因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平

按比例稱取覆盆子、韭子、益智、山楂、火麻仁藥材9份，按L（934）正交表條件進行試驗，試驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結果（n=3）

表3 方差分析

OD=［（總黃酮含量∕總黃酮含量最大值）×M1+（補骨脂素含量∕補骨脂素含量最大值）×M2+（圓柚酮含量∕圓柚酮含量最大值）×M3］×100%（M1總黃酮權重；M2補骨脂素權重；M3圓柚酮權重，均由熵權法求取）。結果按熵權法計算權重，M1、M2、M3分別為0.336 9、0.335 1、0.328 0，將試驗結果進行綜合分析，并對結果進行直觀分析和方差分析，各因素對提取工藝的影響為提取次數＞乙醇體積分數＞溶劑量＞提取時間。提取次數、乙醇體積分數及溶劑量對提取量的影響顯著，提取時間的影響不顯著，最優因素水平組合為A3B3C1D2，即乙醇體積分數為70%，溶劑量為12倍，提取時間1.0 h，提取2次。

按比例取補骨脂、覆盆子、益智、火麻仁、山楂、韭子3份，按上述提取工藝進行提取，計算總黃酮、補骨脂素、圓柚酮提取量，結果見表4。由表4可知，總黃酮、補骨脂素、圓柚酮提取量接近正交試驗中的最大值，表明該提取工藝合理。

表4 驗證試驗結果（n=3）

3 討論

益根調理膏中覆盆子的主要化學成分為黃酮、生物堿和酚酸類等，覆盆子70%乙醇提取物對小鼠腎陽虛有一定的改善作用，氯仿部位和乙酸乙酯部位能改善腎陽虛型癡呆大鼠的學習記憶能力，覆盆子素補腎活性強［1-5］。補骨脂主要含香豆素類、黃酮類等化學成分，香豆素類對腎陽虛、脾虛有改善作用，補骨脂乙醇提取物與其溫補腎陽作用有關［6，7］。益智主要化學成分為萜類、黃酮類等，益智醇提物能減少腎陽虛大鼠的尿量，圓柚酮為其溫腎縮尿的主要成分之一［8-13］。韭子含有生物堿類、香豆素類、皂苷、氨基酸和揮發油等成分，韭子70%乙醇提取物能改善腎虛和腎陽虛作用，具有溫腎助陽的功效［14-16］。火麻仁主要活性成分為油脂、蛋白質和揮發油等［17-19］。山楂主要含有黃酮類、維生素類、糖類和礦物質等活性成分，其黃酮類具有保肝和抗氧化等功效［20-22］。因此根據處方中藥有效成分的理化性質以及有效部位特點，結合影響藥物醇提工藝的因素［23，24］，以總黃酮、補骨脂素、圓柚酮為考察指標，乙醇為溶媒，以乙醇體積分數、溶劑量、提取時間、提取次數為因素，采用正交試驗結合熵權法計算各指標權重系數優化醇提工藝參數。

采用高效液相色譜法對補骨脂素和圓柚酮進行測定、紫外分光光度法對總黃酮進行測定，并對測定方法進行了方法學研究，研究結果表明所采用的方法均滿足藥典規定的方法學驗證要求。

補骨脂素和圓柚酮在同一個色譜條件中以梯度洗脫難以達到分離要求，對其含量測定造成一定影響，因此為了使其含量測定更加穩定、分離效果更好，設計了兩個等梯度洗脫法色譜條件。

熵權法是一種客觀賦權法，僅依賴于數據本身的離散性［25］。本研究選用熵權法確定醇提工藝各指標的客觀權重，根據權重得出綜合指標，能更全面反映各成分在提取過程中的提取效果，引入熵權法確定權重避免了主觀確定權重的隨意性，具有直觀性好、靈活方便等優點。