基于生物信息學(xué)分析人狼瘡腎炎血中相關(guān)差異基因

崔道林，陳春麗

（曲靖醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，云南曲靖 655000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種因免疫系統(tǒng)對自身抗原免疫耐受減弱或消失而導(dǎo)致的自身免疫性疾病。臨床多發(fā)生以免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子浸潤、腎小球和腎小管間質(zhì)損失為特征的狼瘡腎炎（lupus nephritis，LN）。據(jù)統(tǒng)計，多達(dá)60%的SLE并發(fā)癥為LN〔1〕，約有10%的LN會發(fā)展為終末期腎衰竭〔2〕，最終患者需要通過透析或器官移植來維持生命。因此，LN是導(dǎo)致殘疾和死亡的重要原因。

LN在缺乏最佳治療的情況下，Ⅳ型2年死亡率高于90%，Ⅲ型4年死亡率接近50%，而Ⅱ型的預(yù)后要好得多，4年死亡率約為10%〔3〕。因此，早期的診斷和治療會大幅度提高LN患者的生存率。傳統(tǒng)的LN檢查指標(biāo)，如血肌酐、蛋白尿、血尿、抗-dsDNA、抗-Sm等，仍然是LN的重要生物標(biāo)志物。腎活檢是評估LN的金標(biāo)準(zhǔn)，但它是一項侵入性手術(shù)，即使經(jīng)驗豐富的專家，對腎臟進(jìn)行經(jīng)皮穿刺活檢也會有一定風(fēng)險。目前，理想的能識別出患病風(fēng)險并應(yīng)用于臨床的LN生物標(biāo)志物尚未見報道，因此探尋LN生物標(biāo)志物具有十分重要的意義。

LN當(dāng)前的治療方法主要是非特異性減少炎癥的高劑量類固醇激素與減少自身抗體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性藥物的組合，非特異性免疫抑制方案仍然是LN治療的核心。然而，該治療方法具有明顯的副作用，緩解率不足。

血液中含有與LN相關(guān)的巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞。由于LN患者的血液容易采集，核酸檢查成本低且結(jié)果精準(zhǔn)，使其成為LN生物標(biāo)志物的理想來源。本研究基于GEO芯片數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)方法篩選LN血液中的差異基因。通過GO功能富集分析和KEGG信號通路分析，獲取差異基因的主要功能和參與的關(guān)鍵免疫途徑。通過STRING數(shù)據(jù)庫（https：∕∕string-db.org∕）構(gòu)建蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，篩選關(guān)鍵基因，旨在探尋LN在血液中的生物標(biāo)志物和生物制劑的特異性靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 通過GEO（https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕gds∕）數(shù)據(jù)庫下載基因芯片GSE72747，輸入類型“Series”，種屬為“Homo sapiens”，研究類型為“Expression profiling by array”，數(shù)據(jù)注釋平臺為GPL570。免疫治療前，LN患者血樣10例（GS M 1 8 6 9 3 9 6，G S M 1 8 6 9 3 9 9，GS M 1 8 6 9 4 0 2，GS M 1 8 6 9 4 0 5，G S M 1 8 6 9 4 0 8，GS M 1 8 6 9 4 1 1，GS M 1 8 6 9 4 1 4，GSM1 8 69 4 1 7，GSM1 8 69 4 2 0，GSM1 8 69 4 2 3），免疫治療3個月后LN患者血樣10例（GSM1869397，GSM1 8 6 9 4 0 0，GSM 1 8 6 9 4 0 3，GS M 1 8 6 9 4 0 6，GS M 1 8 6 9 4 0 9，GSM1 8 6 9 4 1 2，GS M 1 8 6 9 4 1 5，GS M 1 8 6 9 4 1 8，GSM1 8 6 9 4 2 1，GSM1869424），免疫治療6個月后LN患者血樣10例（GSM1869398，GSM1869401，GSM1 8 6 9 4 0 4，G S M 1 8 6 9 4 0 7，G S M 1 8 6 9 4 1 0，GS M1 8 6 9 4 1 3，GSM1 8 6 9 4 1 6，GSM1 8 6 9 4 1 9，GSM1 8 6 9 4 2 2，GSM1 8 6 9 4 2 5）。

1.2 差異表達(dá)基因的提取和分析 從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE72747芯片的Series Matrix File（s）和數(shù)據(jù)注釋平臺GPL570的文件，運(yùn)用“probeconvertsymbol.pl”腳本將探針信息轉(zhuǎn)變成基因名稱，利用R軟件引用“sva”和“l(fā)imma”包對數(shù)據(jù)進(jìn)行批次矯正，接著引用“l(fā)imma”包獲取差異表達(dá)基因、上調(diào)基因和下調(diào)基因并分別保存在3個Excel文件中。差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|logFC|＞1且adjustP＜0.05。

1.3 差異表達(dá)基因的富集分析 運(yùn)用R軟件引用“clusterProfiler”和“pathview”包對差異基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號通路分析。從已經(jīng)篩選到的上調(diào)基因和下調(diào)基因中，找出差異基因在LN中的功能和最有可能參與的信號通路。

1.4 差異表達(dá)的PPI構(gòu)建 STRING數(shù)據(jù)庫是一個在線搜索已知蛋白質(zhì)以及預(yù)測PPI的數(shù)據(jù)庫，包括蛋白質(zhì)之間直接物理相互作用以及間接功能的相關(guān)性。關(guān)鍵參數(shù)設(shè)置：“Multiple proteins”“Homo sapiens”“medium confidence（0.400）”“hide disconnected nodes in the network”。利用STRING數(shù)據(jù)庫獲得的文件“string_interactions.tsv”，運(yùn)用R 3.6.1軟件分析前30個關(guān)鍵基因出現(xiàn)的頻率，并將其進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的提取及可視化 GSE72747芯片數(shù)據(jù)處理后，共篩選到59個差異表達(dá)基因，20個為上調(diào)基因（占33.9%），39個為下調(diào)基因（占66.1%）。見表1。

表1 狼瘡腎炎未治療組與狼瘡腎炎治療組差異基因

2.2 GO功能富集分析和KEGG信號通路分析 通過R 3.6.1軟件對篩選到的59個差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號通路分析。GO功能富集分析結(jié)果顯示：差異基因主要富集在抗原結(jié)合、Fcγ受體（FcγR）結(jié)合、跨膜受體蛋白、蛋白結(jié)合等方面。見表2。KEGG信號通路分析結(jié)果顯示：腺苷酸活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路和mTOR信號通路與LN的免疫治療相關(guān)。見表3。

表2 差異表達(dá)基因GO功能富集分析

表3 差異表達(dá)基因KEGG信號通路分析

2.3 PPI構(gòu)建 通過STRING數(shù)據(jù)庫獲得差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，一共有30個節(jié)點(diǎn)，54個互作關(guān)系。見圖1。出現(xiàn)頻率最高的5個差異基因：（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZ H2）8次，（immunoglobulin lambda like polypeptide 5，IGLL 5）7次，（membrane spanning 4-domains A1，M S 4A1）7次，（paired box 5，PAX5）7次，（CD38 molecule，C D38）6次。見圖2。

圖2 關(guān)鍵基因出現(xiàn)的頻率

3 討論

本研究首先篩選出LN免疫治療前后血液中59個差異表達(dá)基因。GO功能富集分析結(jié)果顯示差異基因的主要功能為FcγR結(jié)合和抗原結(jié)合，提示這些基因參與了LN的發(fā)病機(jī)制〔4-8〕。腎臟中免疫復(fù)合物的沉積被認(rèn)為是導(dǎo)致LN炎癥的原因，沉積的免疫復(fù)合物激活FcγR，從而促進(jìn)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活〔4〕。FcγR還可以激活體內(nèi)Toll樣受體（TLR），包括TLR7和TLR9，從而增加炎癥反應(yīng)〔5〕。多項研究表明FcγR基因與SLE易感性相關(guān)，并與LN相關(guān)〔6〕。當(dāng)抗原暴露在免疫系統(tǒng)時，抗原提呈細(xì)胞（APC）對抗原進(jìn)行加工，形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物。常見的先天免疫系統(tǒng)的專業(yè)APC為樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，已成為LN發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵細(xì)胞群〔7〕。T淋巴細(xì)胞的活化依賴于抗原肽-MHC分子復(fù)合物，效應(yīng)CD8+T淋巴細(xì)胞對靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，效應(yīng)CD4+T淋巴細(xì)胞可輔助B淋巴細(xì)胞活化為漿細(xì)胞。漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗原可以與抗原發(fā)生特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，產(chǎn)生過敏毒素（C3a、C4a、C5a）、調(diào)理素（C3b、C4b、iC3b）、攻膜復(fù)合體（MAC）等物質(zhì)，其中C5a還是中性粒細(xì)胞的趨化因子，浸潤的炎性細(xì)胞通過腎小球和間質(zhì)血管進(jìn)入腎臟，并導(dǎo)致組織損傷〔8〕。

KEGG信號通路分析顯示，差異基因主要在AMPK信號通路富集。研究表明，通過阻斷AMPK信號通路，不但能顯著降低白細(xì)胞介素1（IL-1）和高遷移率族蛋白1（HMGB1）的表達(dá)量〔9〕，而且可以抑制NLRP3炎性小體的活化和抑制caspase-1誘導(dǎo)的凋亡〔10〕。AMPK信號通路促進(jìn)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞〔11〕。

根 據(jù)PPI網(wǎng) 絡(luò) 篩 選 出EZH2，IGLL5，MS4A1，PAX5，CD38等基因。EZH2屬于多梳家族蛋白（PcG）家族，參與DNA的甲基化，通過基因沉默來控制表觀遺傳〔12〕，到目前為止，沒有文獻(xiàn)表明EZH2與LN直接相關(guān)，EZH2可能通過甲基化調(diào)控與LN的相關(guān)基因。多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種惡性漿細(xì)胞腫瘤，研究表明IGLL5可能是MM的生物標(biāo)志物〔13〕。MS4A1也稱為CD20，是正常B淋巴細(xì)胞和各種類型B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的重要標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)MS4A1是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的靶點(diǎn)，TGF-β通過降低MS4A1∕CD20的表達(dá)來誘導(dǎo)B細(xì)胞淋巴瘤Ramos細(xì)胞凋亡〔14〕。PAX5是一種在造血系統(tǒng)中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在B淋巴細(xì)胞的發(fā)育、成熟和分化過程中發(fā)揮重要作用〔15〕，因此，抑制PAX5的表達(dá)可以影響B(tài)淋巴細(xì)胞的發(fā)育、成熟和分化。CD38是一種Ⅱ型糖蛋白，參與細(xì)胞黏附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，漿細(xì)胞是表達(dá)CD38最多的細(xì)胞，其次是NK細(xì)胞（自然殺傷細(xì)胞）以及B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞〔16〕，這種表達(dá)模式使CD38可能成為LN治療的理想靶標(biāo)，旨在消除產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞。總之，除EZH2參與表達(dá)調(diào)節(jié)外，IGLL5，MS4A1，PAX5，CD38與漿細(xì)胞有著密切關(guān)系，在大多數(shù)自身免疫性疾病中，漿細(xì)胞通常被認(rèn)為是致病性的，因為它們能夠分泌自身抗體〔17〕。

綜上所述，通過生物信息學(xué)方法篩選出LN免疫治療前后血液中的5個關(guān)鍵基因：EZH2，IGLL5，MS4A1，PAX5，CD38。這些基因既可作為潛在生物標(biāo)志物用于LN的早期診斷，也可作為潛在特異性靶點(diǎn)指導(dǎo)LN的藥物研發(fā)。