百里醌對腦小血管病大鼠認知功能及氧化應激的影響

李歌 代云 冀梁 關東升

河南中醫藥大學第二臨床醫學院（鄭州450003）

腦小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）是一種與年齡密切相關的高患病率疾病，并且是造成認知障礙的主要原因，其引起的認知功能障礙在血管性癡呆中占比35% ～67%［1］。目前有研究發現氧化應激為發病的關鍵，其通過干擾一氧化氮信號通路損害腦血管的功能，并與CSVD引起的動脈非淀粉樣變和淀粉樣變以及其重要危險因素密切相關［2-3］。

中醫藥理學研究顯示，百里醌有抗氧化應激、抗炎癥反應、抗細胞凋亡、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等廣泛的生物學活性［4-5］。更有研究表明，百里醌是有效的親氧化劑，可維持多種抗氧化酶的還原性［6］，能緩解輻射小鼠的氧化損傷，降低癲癇持續狀態大鼠的腦損傷［7］。相關研究發現，百里醌可在葡萄酸鈉小鼠結腸炎模型中上調結腸組織中谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，下調丙二醛（MDA）水平［8］。

至今，有關百里醌對CSVD 認知功能和氧化應激的研究甚少，本研究選用SHRsp 大鼠模型以研究氧化應激與CSVD 發病的關系，并探討百里醌治療CSVD 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器10 只15 周齡雄性SD 大鼠；30 只15 周齡雄性卒中易感型自發性高血壓大鼠，SPF 級，體質量250 ～300 g，購自上海SLK 生物科技有限公司，給予標準光照周期（12 h光照，12 h 黑夜），室內溫度（21±2）℃，濕度50%～70%，飼養條件均符合國家標準GB14925-2010 規定。實驗在河南省中醫院實驗動物中心進行，使用許可證號【SYXK（豫）2016-0009】。百里醌購自美國Sigma 公司。SOD 測定試劑盒（A001-3-2）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（A007-1-1）、GSH 測定試劑盒（A006-1-1）、MDA 測定試劑盒（A003-1-1）、活性氧（ROS）測定試劑盒（E004-1-1）均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物分組及給藥喂養前進行神經行為學評分［9］，評分在1 ～3 分顯示模型成功，繼續進行后續的實驗。適應性喂養10 d 后，將30 只SHRsp大鼠隨機分為模型組、低劑量（25 mg/kg）和高劑量（50 mg/kg）百里醌組，每組10只，口服給藥，共4周，并以10 只SD 大鼠為對照組。低和高劑量的百里醌組分別給予25 和50 mg/kg 百里醌，對照組和模型組大鼠給予等量賦形劑。療程4 周后，模型組死亡脫落2 只。神經行為學評分標準見表1。

表1 神經行為學評分標準Tab.1 Neurobehavioral scoring standards

1.3 Morris 水迷宮試驗參照Morris 水迷宮試驗方法［10］，實驗歷經5 d，實驗第1 天將大鼠在未放置平臺的水池中自由游泳2 min，以適應實驗環境。從第2 天起，每天進行4 次登臺試驗，分別在水池不同位置釋放大鼠，記錄大鼠尋找隱藏平臺所花費的時間（即逃避潛伏期），60 s 內未找到平臺，成績仍按60 s 計算。在試驗第6 天撤除透明平臺，任選一個水池位置釋放大鼠，進行探索試驗，記錄120 s 內大鼠穿越原平臺象限次數和在目標象限所花費的時間。

1.4 新物體識別試驗給藥4 周后，考察大鼠自主活動進行記憶獲取的能力，記錄動物對2 個物體各自的學習時間。在短期記憶試驗中，在二次訓練180 min 后替換1 個新物體，在5 min 的檢測周期中記錄大鼠對新物體和舊物體的探索時間。在長期記憶試驗中，在二次訓練24 h 后替換1 個新物體，在5 min 的檢測周期中記錄大鼠對新物體和舊物體的探索時間。以鑒別指數（新物體探索時間/新物體探索時間＋舊物體探索時間）評價大鼠對新舊物體的認知能力和記憶水平。

1.5 氧化應激相關指標測定認知功能評測結束后，迅速將實驗動物斷頭取腦，冰上分離腦組織，取腦組織塊在低溫氯化鈉溶液中漂洗，去除血液，放入燒杯中，在燒杯中加入低溫氯化鈉溶液，并剪碎腦組織塊。將剪碎的腦組織塊混懸液倒入勻漿管中進行充分勻漿，后將勻漿液以4 000 r/min 離心15 min，取上清液冰凍于-80 ℃貯存備用。氧化應激指標（SOD、CAT、GSH、MDA、ROS）根據試劑盒說明書步驟進行檢測。

1.6 統計學方法實驗數據均采用SPSS 21.0 統計軟件進行處理，計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用完全隨機設計單因素方差分析，方差齊采用LSD 檢驗方法，方差不齊采用Dunnett's T3 檢驗方法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 百里醌可改善SHRsp 大鼠的認知功能

2.1.1 百里醌對SHRsp 大鼠逃避潛伏期、目標象限停留時間和穿越原平臺象限次數的影響Morris水迷宮期間，大鼠的逃避潛伏期隨訓練時間呈逐漸降低的趨勢。模型組大鼠與對照組比較，逃避潛伏期時間顯著延長（P＜0.01），目標象限的停留時間顯著縮短（P＜0.01），穿越原平臺象限次數顯著減少（P＜0.01）。同時與模型組比較，百里醌低劑量和高劑量組大鼠逃避潛伏期均顯著縮短（P＜0.05），目標象限的停留時間顯著增加（P＜0.05），穿越原平臺象限次數明顯增多（P＜0.05）。結果表明：百里醌可顯著改善SHRsp 大鼠的學習記憶能力。見表2-4。

表2 百里醌對SHRsp 大鼠逃避潛伏期的影響Tab.2 The effect of thymoquinone on the escape latency of SHRsp rats±s

表2 百里醌對SHRsp 大鼠逃避潛伏期的影響Tab.2 The effect of thymoquinone on the escape latency of SHRsp rats±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

劑量逃避潛伏期（s）組別對照組模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組（mg/kg）25 50第1 天38.43±2.18 42.00±1.14##40.30±0.94*39.35±1.93**第2 天19.33±3.11 32.15±3.49##27.77±3.53*25.95±3.73**第3 天12.13±3.77 25.29±3.08##21.11±3.88*18.40±2.71**第4 天10.83±2.18 20.60±4.47##16.57±3.34*14.90±3.54**第5 天9.90±2.54 20.33±13.30##15.02±2.21**14.24±3.94**

表3 百里醌對SHRsp 大鼠目標象限停留時間的影響Tab.3 The effect of thymoquinone on the residence time in the target quadrant of SHRsp rats±s

表3 百里醌對SHRsp 大鼠目標象限停留時間的影響Tab.3 The effect of thymoquinone on the residence time in the target quadrant of SHRsp rats±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

組別劑量（mg/kg）目標象限停留時間（s）對照組模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組25 50 45.94±5.97 32.79±7.58##39.79±4.50*42.81±4.25**

2.1.2 百里醌對SHRsp 大鼠短期、長期記憶的影響在短期和長期記憶試驗中，模型組大鼠與對照組比較，探索新物體的時間縮短（P＜0.01），表明模型組大鼠存在明顯的學習記憶障礙。與模型組比較，百里醌低劑量和高劑量組大鼠探索新物體的時間顯著增長（P＜0.05），見表5、6。鑒別指數表明，模型組大鼠區分新物體和舊物體的能力降低。百里醌治療使SHRsp大鼠在短時和長時記憶試驗中區分新物體和舊物體的能力升高，見表7、8。基于上述結果，表明百里醌可顯著改善SHRsp 大鼠的學習記憶能力。

表4 百里醌對SHRsp 大鼠穿越原平臺象限次數的影響Tab.4 The effect of thymoquinone on the number of times that SHRsp rats cross the original platform±s

表4 百里醌對SHRsp 大鼠穿越原平臺象限次數的影響Tab.4 The effect of thymoquinone on the number of times that SHRsp rats cross the original platform±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

組別劑量（mg/kg）穿越原平臺象限次數（次）對照組7.70±0.82模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組25 50 2.50±0.93##4.30±0.95*6.20±0.79**

表5 百里醌對SHRsp 大鼠短期記憶的影響Tab.5 The effect of thymoquinone on short-term memory in SHRsp rats±s

表5 百里醌對SHRsp 大鼠短期記憶的影響Tab.5 The effect of thymoquinone on short-term memory in SHRsp rats±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

劑量探索新物體的時間（s）mg/kg）1 周2 周3 周4 周組別對照組模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組（25 50 8.29±1.37 3.87±0.76##5.25±1.35*6.53±1.57**7.65±1.68 3.54±1.24##5.39±1.81*6.85±1.57**7.60±1.68 3.43±1.24##5.31±1.81*6.39±1.57**7.41±1.68 3.13±1.24##4.87±1.81*6.21±1.57**

表6 百里醌對SHRsp 大鼠長期記憶的影響Tab.6 The effect of thymoquinone on the long-term memory of SHRsp rats±s

表6 百里醌對SHRsp 大鼠長期記憶的影響Tab.6 The effect of thymoquinone on the long-term memory of SHRsp rats±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

劑量探索新物體的時間（s）（mg/kg）1 周2 周3 周4 周7.38±1.707.14±1.707.10±1.707.05±1.70組別對照組模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組25 50 3.40±1.22##5.30±1.35*6.05±1.57**3.33±1.22##4.91±1.35*5.86±1.57**3.08±1.22##4.74±1.35*5.80±1.57*2.95±1.22##4.55±1.35*5.46±1.57**

表7 百里醌對SHRsp 大鼠短期記憶辨別指數的影響Tab.7 The effect of thymoquinone on the short-term memory discrimination index of SHRsp rats±s

表7 百里醌對SHRsp 大鼠短期記憶辨別指數的影響Tab.7 The effect of thymoquinone on the short-term memory discrimination index of SHRsp rats±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

劑量探索新物體的辨別指數（%）（mg/kg）1 周2 周3 周4 周0.58±0.050.59±0.060.58±0.070.57±0.05組別對照組模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組25 50 0.49±0.04#0.54±0.06*0.56±0.04*0.47±0.05#0.53±0.04*0.57±0.04*0.46±0.06#0.52±0.05*0.56±0.06*0.45±0.04#0.52±0.03*0.55±0.06*

表8 百里醌對SHRsp 大鼠長期記憶辨別指數的影響Tab.8 The effect of thymoquinone on the long-term memory discrimination index of SHRsp rats±s

表8 百里醌對SHRsp 大鼠長期記憶辨別指數的影響Tab.8 The effect of thymoquinone on the long-term memory discrimination index of SHRsp rats±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

劑量探索新物體的辨別指數（%）組別對照組模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組（mg/kg）25 50 1 周0.56±0.04 0.45±0.05#0.57±0.05*0.58±0.04*2 周0.54±0.06 0.43±0.05#0.56±0.06*0.58±0.07*3 周0.57±0.07 0.44±0.06#0.54±0.06*0.56±0.04*4 周0.56±0.08 0.41±0.06#0.55±0.08*0.57±0.09*

2.2 百里醌可抑制SHRsp 大鼠腦部的氧化應激SHRsp 大鼠模型組相比對照組，腦中的SOD、CAT 的活性和GSH 的含量顯著減少（P＜0.01），MDA、ROS 的水平明顯增加（P＜0.01）。百里醌低劑量和高劑量組與模型組比較，腦中SOD、CAT（P＜0.05）的活性和GSH（P＜0.01）的含量明顯增加，MDA、ROS 的水平較模型組明顯減少（P＜0.05）上述實驗結果表明：百里醌對SHRsp 大鼠具有抗氧化的功能。見表9。

表9 百里醌對SHRsp 大鼠氧化應激的影響Tab.9 The effect of thymoquinone on oxidative stress in SHRsp rats±s

表9 百里醌對SHRsp 大鼠氧化應激的影響Tab.9 The effect of thymoquinone on oxidative stress in SHRsp rats±s

注：與對照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

kg）氧化應激相關指標組別對照組模型組低劑量百里醌組高劑量百里醌組劑量（mg/25 50 SOD（U/mg）17.88±2.93 5.36±0.95##8.57±0.85*14.46±2.65**CAT（U/mg）11.41±2.54 3.73±0.44##5.50±1.32*9.26±1.93**MDA（nmol/mg）0.13±0.03 0.46±0.08##0.33±0.05*0.27±0.07**GSH（μg/mg）5.65±2.00 1.15±0.42##2.76±0.86**4.47±1.02**ROS（U/mL）1.01±0.01 3.26±0.05##2.73±0.95*2.31±0.19**

3 討論

CSVD 是一種全身性的慢性重大疾病，是老年人中常見的腦血管疾病，為老齡化社會帶來了沉重的負擔。認知功能障礙為其常見的臨床表現。CSVD 引起的認知損害主要涉及注意力、處理速度、執行功能等認知域，而對記憶的損害相對較輕［11］。目前，CSVD 的發病機制涉及腦慢性缺血/低灌注、血腦屏障受損、內皮功能障礙、氧化應激以及炎癥等［12］。其中，氧化應激是其關鍵作用機制，抗氧化干預成為治療CSVD 的新策略［13-14］。

本研究采用SHRsp 大鼠模型，該模型大鼠在10 周前自行發展出穩定的動脈高壓，逐漸進展致9 ～10 個月內可出現腦卒中或腦出血，導致學習記憶功能嚴重受損［15］。SHRsp 大鼠尾狀核、胼胝體等腦區存在腦部小血管血栓形成和腦白質病變，與CSVD 的病變特征一致［16］。

氧化應激是CSVD 的主要病理機制，由于腦組織代謝旺盛，需氧量高，導致生成大量的ROS，但腦組織自身缺乏抗氧化物質，更容易受到后者侵害［17-18］。MDA 是脂質過氧化反應的終產物，其水平高低可反映細胞損傷的程度。GSH、SOD、CAT均是體內重要的抗氧化劑，可清除細胞中ROS，具有保護細胞免受氧化損傷的作用。前期研究發現，CSVD 患者血漿中脂質過氧化產物含量顯著高于正常人群，且其臨床不良預后與其基線氧化應激水平正相關［19-20］。

目前，CSVD 相關認知障礙尚無特效藥，改善微循環、營養腦神經對其治療作用有限。中醫學理論認為，CSVD 相關認知障礙屬“癡呆病”的范疇，本病與脾關系密切，脾虛失運是其形成的主要內因，脾運正常，則腎精得充，神機得用［21］。《靈樞·平人絕谷論》中指出：“故神者，水谷之精氣也”，認為氣血充盛是神志活動的重要物質基礎。脾為后天之本，氣血生化之源，其與情志的關系可概括為：“脾藏意”。脾無法發揮運化的功能，氣血生化乏源，最終無法承載思維、記憶功能而發為癡呆。筆者認為CSVD 相關認知障礙以脾虛為本，痰濕交阻為標，病位在腦，當以健脾益氣、祛痰化濕為主。

苜蓿的主要功能為“清脾胃、利大小腸，下膀胱結石”，《本草綱目》中記載其“安中利入，可久食、利五臟、輕身健人。”脾氣虛脾失健運，氣血失調導致抗氧化酶活性降低，引起脂質過氧化反應增強［22］。既往研究［23］表明，補脾中藥可提高機體抗氧化的能力，進而改善認知功能。百里醌作為苜蓿的提取物，通過健脾益氣達到祛痰化濕的作用，從而通利五臟氣機，氣血運行通暢，治療本病。綜上所述，百里醌可能通過抑制SHRsp 大鼠的氧化應激，從而改善CSVD 大鼠的認知功能障礙。因此百里醌可能是臨床上應用于治療CSVD 的有效中藥提取物，提供了科學的依據。但本研究樣本較小，觀察指標有限，百里醌對CSVD 相關認知功能障礙的治療作用機制仍待進一步的研究。