延齡草苷通過上調miR-1247-3p表達減輕高糖誘導的視網膜血管內皮細胞損傷

馬金蘭 王青 牛浩宇

1青海大學附屬醫院眼科（西寧810001）；2青海大學醫學院眼科（西寧810001）

糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病常見的并發癥之一，也是導致成年人失明的主要原因［1］。目前，DR 的發病機制尚未明確，且缺乏有效的治療藥物，一般認為持續的高血糖誘導的視網膜血管內皮細胞損傷是其發生的基礎［2］。延齡草苷是延齡草的主要活性成分之一，具有抗炎、抗癌等功效［3-4］。研究［5］顯示，延齡草苷可通過調控Sirtl/NFκB 信號通路提高過氧化氫誘導的PC12 細胞抗氧化能力，并降低細胞炎性因子表達，保護PC12 細胞損傷。但目前，延齡草苷是否影響高糖誘導的視網膜血管內皮細胞損傷尚未明確。

微小RNA（miRNA）是一類小分子非編碼RNA，在細胞氧化應激、炎癥反應及凋亡中發揮重要作用［6-8］。研究［9］顯示，過表達miR-1247-3p 可減少氧-糖剝奪/復氧處理的神經細胞凋亡，減輕缺血再灌注腦損傷。但目前，miR-1247-3p 對高糖誘導的視網膜血管內皮細胞損傷的影響也還未知。本研究以人視網膜血管內皮細胞（HRVEC）為研究對象，主要觀察了延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 細胞氧化應激和凋亡的影響及其能否調控miR-1247-3p 表達發揮作用，以期為DR 的治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑人視網膜血管內皮細胞（HRVEC），上海雅吉生物科技有限公司；延齡草苷，純度≥98%，上海鈺博生物科技有限公司；胎牛血清（FBS），杭州四季青；DMEM 培養基，北京索萊寶；Trizol 試劑、逆轉錄試劑盒和PCR 試劑盒，大連寶生物；和LipofectamineTM2000 試劑盒，美國Invitrogen 公司；PCR 引物、miR-1247-3p 模擬物（mimcs）、模擬對照序列（miR-NC）、miR-1247-3p 抑制劑（anti-miR-1247-3p）、抑制劑陰性序列（antimiR-NC），上海生工，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和活性氧（ROS）試劑盒，南京建成；二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒和Annexin VFITC/PI 凋亡試劑盒；上海碧云天；兔抗人B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、B 淋巴細胞瘤-2 相關蛋白（Bax）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體，美國Santa Cruz 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染用含10 % FBS 的DMEM培養基培養HRVEC。將HRVEC 接種于6 孔板中（1 × 105個/孔），用LipofectamineTM2000 脂質體法，分別轉染miR-1247-3p mimcs、miR-NC 組、anti-miR-1247-3p、anti-miR-NC。轉染6 h 后，更換培養基。再培養24 h，收集細胞用于后續實驗。

1.2.2 分組處理未轉染的HRVEC 細胞及轉染后的細胞接種于24 孔板中（2.5×104個/孔）。未轉染的HRVEC 細胞分為對照組（細胞用常規培養基培養）、高糖組（細胞用含30 mmol/L［10］葡萄糖的培養基培養）、高糖+延齡草苷低劑量組（5 μmol/L［5］延齡草苷與30 mmol/L 葡萄糖共同培養）、高糖+延齡草苷中劑量組（10 μmol/L 延齡草苷與30 mmol/L 葡萄糖共同培養）和高糖+延齡草苷高劑量組（20 μmol/L延齡草苷與30 mmol/L葡萄糖共同培養）。轉染miR-1247-3p mimcs、miR-NC 的細胞用含30 mmol/L 葡萄糖的培養基培養，記為高糖+miR-1247-3p、高糖+miR-NC。轉染anti-miR-1247-3p、anti-miR-NC 的細胞用含20 μmol/L 延齡草苷與30 mmol/L 葡萄糖的培養基共同培養。每組設3 個復孔。培養24 h 后，檢測以下指標。實驗重復3 次。

1.2.3 DCFH-DA 法檢測ROS細胞培養后，棄培養基，加入2 mL終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA工作液，孵育40 min，收集細胞，流式細胞儀檢測熒光強度，其中激發波長488 nm，發射波長520 nm。

1.2.4 酶聯免疫吸附法檢測MDA 和SOD細胞培養后，收集細胞，加裂解液裂解，3 500 r/min 離心10 min，上清液-20 ℃保存備用。分別利用MDA 和SOD試劑盒，檢測上清液中MDA含量和SOD活力。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡細胞培養后，收集細胞，PBS 清洗2 次，利用Annexin V-FITC/PI試劑盒，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-1247-3p 表達Trizol 試劑提取細胞中總RNA，逆轉錄為cDNA，行PCR 擴增。擴增程序：95 ℃10 min，95 ℃10 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個循環。引物序列：miR-1247-3p 上游5'-CAGTGC ATAGCCACGTAACG-3'，下游5'-GCCGTAACCACTAATCCG-3'；內參U6 上游5'-CTGAACAGGTCCCTAAGCTAC-3'，下游5'-CGTAATCCGTGACTGCTCG-3'。2-△△Ct法計算miR-1247-3p 相對U6 的表達量。

1.2.7 Western blot 法檢測Bax 和Bcl-2 蛋白表達RIPA 試劑提取細胞中總蛋白，經BCA 法定量、SDS-PAGE 電泳、轉膜和封閉后，分別于Bax 和Bcl-2 一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。再于山羊抗兔孵育液中，37 ℃孵育1 h。加化學發光試劑避光顯影，曝光拍照。

1.3 統計學方法GraphPad Prism 7.0 軟件分析實驗數據。計量資料以均數±標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用t檢驗。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 氧化應激的影響與對照組比較，高糖組ROS 和MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）。與高糖組比較，高糖+延齡草苷不同劑量組ROS 和MDA水平降低（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05），且不同劑量組間各檢測指標兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 氧化應激的影響Tab.1 The effect of trillin on oxidative stress of HRVEC induced by high glucose±s

表1 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 氧化應激的影響Tab.1 The effect of trillin on oxidative stress of HRVEC induced by high glucose±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與高糖組比較，#P ＜0.05；與高糖+延齡草苷低劑量組比較，&P ＜0.05；與高糖+延齡草苷中劑量組比較，$P ＜0.05

ROS 水平（%）SOD 活性（U/mg）MDA 含量（nmol/mg）100.00±7.52169.39±10.845.49±0.54 292.36±15.47*47.57±4.56*24.79±2.07*劑量組228.50±14.22#84.08±6.79#19.92±1.15#劑量組179.33±11.78#&113.65±8.87#&14.68±1.13#&分組對照組高糖組高糖+延齡草苷低高糖+延齡草苷中高糖+延齡草苷高劑量組F 值P 值128.39±11.30#&$351.355＜0.001 143.32±9.19#&$298.045＜0.001 8.33±0.79#&$366.982＜0.001

2.2 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 凋亡的影響與對照組比較，高糖組細胞凋亡率和Bax 蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）。與高糖組比較，高糖+延齡草苷不同劑量組細胞凋亡率和Bax 蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平升高（P＜0.05），且不同劑量組間各檢測指標兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、表2。

表2 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 凋亡的影響Tab.2 The effect of trillin on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose±s

表2 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 凋亡的影響Tab.2 The effect of trillin on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與高糖組比較，#P ＜0.05；與高糖+延齡草苷低劑量組比較，&P ＜0.05；與高糖+延齡草苷中劑量組比較，$P ＜0.05

分組對照組高糖組高糖+延齡草苷低劑量組高糖+延齡草苷中劑量組高糖+延齡草苷高劑量組F 值P 值凋亡率（%）8.04±0.77 34.23±3.01*25.98±2.22#17.49±1.72#&11.59±1.15#&$272.506＜0.001 Bcl-2 蛋白0.67±0.05 0.22±0.02*0.34±0.03#0.46±0.03#&0.58±0.05#&$203.625＜0.001 Bax 蛋白0.29±0.02 0.81±0.06*0.68±0.04#0.55±0.03#&0.38±0.03#&$274.682＜0.001

圖1 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響Fig.1 The effect of trillin on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose and the protein expression of Bcl-2 and Bax

2.3 延齡草苷對高糖誘導的HRVEC中miR-1247-3p 表達的影響與對照組比較，高糖組miR-1247-3p 水平降低［（0.41 ± 0.04）vs.（1.00 ± 0.07），t=21.954，P＜0.05］。與高糖組比較，高糖+延齡草苷不同劑量組miR-1247-3p 水平升高［（0.57±0.04）、（0.69±0.05）、（0.87±0.05）vs.（0.41±0.04），t=8.485、13.119、21.552，均P＜0.05］，且不同劑量組間各檢測指標兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 miR-1247-3p 過表達對高糖誘導的HRVEC氧化應激的影響與高糖+miR-NC 組比較，高糖+miR-1247-3p 組ROS 和MDA 水平降低［（146.74 ±13.65）vs.（297.29±19.17）、（12.15±0.89）vs.（26.78±2.71），t= 19.192、15.387，均P＜0.05］，miR-1247-3p 水平和SOD 活性升高［（2.50 ± 0.21）vs.（1.00 ±0.04）、（124.56±9.55）vs.（45.91±4.17），t=21.050、22.642，均P＜0.05］。

2.5 miR-1247-3p 過表達對高糖誘導的HRVEC凋亡的影響與高糖+miR-NC 組比較，高糖+miR-1247-3p 組細胞凋亡率和Bax 蛋白水平降低［（14.80± 1.15）vs.（36.83 ± 3.02）、（0.45 ± 0.03）vs.（0.84 ±0.06），t= 20.452、17.441，均P＜0.05］，Bcl-2 蛋白水平升高［（0.54±0.03）vs.（0.21±0.02），t=27.458，P＜0.05］。見圖2。

圖2 miR-1247-3p 過表達對高糖誘導的HRVEC 凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響Fig.2 The effect of overexpressing miR-1247-3p on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose and the protein expression of Bcl-2 and Bax

2.6 抑制miR-1247-3p 表達逆轉延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 損傷的影響與高糖+延齡草苷+anti-miR-NC 組比較，與高糖+延齡草苷+anti-miR-1247-3p 組miR-1247-3p 水平降低［（0.38±0.04）vs.（1.00±0.05），t=29.048，P＜0.05］，ROS 和MDA 水平升高［（246.79±11.84）vs.（124.27±10.22）、（17.79± 1.70）vs.（8.13 ± 0.84），t= 23.500、15.283，均P＜0.05］，SOD 活性降低［（58.94 ± 5.73）vs.（144.37 ±14.29），t=16.647，P＜0.05］，凋亡率和Bax 蛋白水平升高［（27.34 ± 2.37）vs.（10.67 ± 1.13）、（0.71 ±0.05）vs.（0.36±0.03），t=19.047、18.007，P＜0.05］，Bcl-2蛋白水平降低［（0.28±0.02）vs.（0.59±0.05），t=17.270，P＜0.05］。見圖3。

圖3 抑制miR-1247-3p 逆轉延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響Fig.3 Inhibiting miR-1247-3p reversed the effect of trillin on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose and the protein expression of Bcl-2 and Bax

3 討論

糖尿病視網膜病變的早期特征為視網膜血管內皮細胞損傷，而持續的高血糖是誘導其發生的主要原因［11-12］。因此，采取有效的措施抑制或降低高血糖誘導的視網膜血管內皮細胞損傷對于糖尿病視網膜病變的治療具有積極意義。作為延齡草的主要活性成分，延齡草苷發揮多種藥理功效。研究［13］顯示，延齡草苷可通過激活AMPK/Sirt1通路抑制肺組織中炎性反應和氧化應激反應，進而降低腦缺血再灌注繼發肺損傷；延齡草苷可抑制脊髓組織中的氧化應激反應，減輕大鼠脊髓損傷［14］。但目前，延齡草苷對高糖誘導的視網膜血管內皮細胞損傷的影響和分子機制還未知。

糖尿病視網膜病變的發病機制十分復雜，其中氧化應激導致的視網膜血管內皮細胞損傷是其機制之一［15］。正常生理條件下，機體內的氧自由基處于動態平衡，而在病理狀態下，自由基的生成和清除平衡被打破，細胞內的SOD 等抗氧化酶的活性降低，造成ROS 含量升高，引起細胞內發生脂質過氧化反應，加劇細胞損傷［16］。MDA 是脂質過氧化產物之一，可間接反映脂質過氧化水平［18］。本研究顯示，高糖誘導HRVEC 細胞后，細胞中ROS和MDA 水平升高，而SOD 活力降低，與相關報道結果一致［19］，表明高糖誘導HRVEC 細胞產生了氧化應激反應；而延齡草苷可降低高糖誘導的HRVEC 細胞中ROS 和MDA 水平，并提高SOD 活力，說明其可抑制高糖誘導的HRVEC 細胞氧化應激反應。

氧化應激可進一步誘導細胞凋亡。Bax和Bcl-2是細胞凋亡的重要調控分子，Bax 表達升高促進細胞凋亡，而Bcl-2 表達升高則抑制細胞凋亡［20-21］。本研究顯示，高糖可能通過調控Bax/Bcl-2 促進HRVEC 細胞，與相關報道結果一致［22］；不同劑量的延齡草苷干預后，高糖誘導的HRVEC 細胞凋亡及Bax 蛋白表達降低，而Bcl-2 蛋白表達升高，表明延齡草苷可有效降低高糖誘導的HRVEC 細胞凋亡。

miRNA 廣泛存在于真核生物中，參與調控細胞的增殖、凋亡、氧化應激等生理或病理過程，與人類多種疾病的發生發展密切相關［23-24］。研究顯示，過表達miR-1247-3p 可減輕缺氧/復氧（H/R）誘導的心肌細胞H9c2 損傷，為急性心肌梗塞的治療提供了分子靶點［25］。本研究結果顯示，高糖可抑制HRVEC 細胞中miR-1247-3p 的表達，而過表達miR-1247-3p 可降低高糖誘導的HRVEC 細胞氧化應激和凋亡，提示miR-1247-3p 可作為治療糖尿病視網膜病變的分子靶點。本研究還顯示，延齡草苷可劑量依賴性促進高糖誘導的HRVEC 細胞中miR-1247-3p 表達，而抑制miR-1247-3p 表達則逆轉了延齡草苷對高糖誘導的HRVEC 細胞氧化應激和凋亡的抑制作用，提示延齡草苷通過上調miR-1247-3p 表達來減輕高糖誘導的HRVEC 細胞損傷。

綜上所述，延齡草苷可有效抑制高糖誘導的HRVEC 細胞氧化應激和凋亡，減輕細胞損傷，其可能通過上調細胞中miR-1247-3p 表達來發揮作用，具有研發為治療糖尿病視網膜病變藥物的潛在價值。本研究接下來將進一步探究miR-1247-3p 靶基因及下游信號通路對高糖誘導的HRVEC細胞損傷的影響，并通過動物實驗進一步驗證延齡草苷對糖尿病視網膜病變發生發展的影響和作用機制。