血管內皮生長因子和促血管生成素2對甲狀腺乳頭狀癌及頸部淋巴結轉移的診斷價值

劉美蓮 蘇法銘 李曉玲 彭曉霞 陳曉銘

廣東醫科大學附屬醫院1腫瘤中心，2內分泌科，3病理科（廣東湛江524023）

甲狀腺乳頭狀癌（thyroid papillary carcinoma，PTC）是最常見的甲狀腺惡性腫瘤之一，大約占甲狀腺惡性腫瘤的89.4%［1］，近年來其發病率呈逐年上升趨勢［2］。隨著人們生活方式的改變，PTC 有低齡化的趨勢，雖然PTC 相比其他惡性腫瘤的預后一般較好［3］，但PTC 并發頸部淋巴結轉移依然會給患者帶來不良的預后，同時有研究表明年齡較小的PTC 患者比年齡較大的PTC 患者在并發頸部淋巴結轉移上更具易感性［4］。合并頸部淋巴結轉移為其不良預后因素，為患者的長期生存帶來了極大的威脅。因此，臨床上積極探索PTC 及其并發頸部淋巴結轉移的分子生物學機制，尋找早期診斷及不良預后的分子標記物，有助于為臨床醫師早期發現和診斷疾病，并及時制定積極治療策略提供有力證據，對于提升PTC 的總體治愈率具有極其重要的意義。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和促血管生成素2（angiopoietins-2，Ang-2）通過相應的信號通路相互影響［5］，在促進腫瘤血管生成及促進淋巴結轉移上可能存在協同作用，目前VEGF 和Ang-2 在PTC中的研究僅有少量文獻報道，且結論不一致。通過檢測上述分子標志物表達，分析其對PTC 及其并發頸部淋巴結轉移的相關性暫未有文獻報道。本研究擬采用免疫組織化學染色方法檢測VEGF和Ang-2 在PTC 組織的表達水平，探討其在PTC 發生及并發頸部淋巴結轉移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料從廣東醫科大學附屬醫院病案室選取2017年12月1日至2019年3月31日經術后病理證實的PCT 患者86 例，其中未并發頸部淋巴結轉移的PTC 患者41 例、已并發頸部淋巴結轉移的PTC 患者45 例。PTC 納入標準：（1）病理診斷提示PTC，未合并其他類型的甲狀腺腫瘤；（2）未合并橋本甲狀腺炎、亞急性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進癥等其他任何甲狀腺疾病；（3）未同時合并結節性甲狀腺腫和PTC；（4）無嚴重的心腦血管疾病。本研究通過廣東醫科大學附屬醫院科研倫理委員會批準，遵循赫爾基辛宣言。

1.2 方法記錄患者的臨床特征信息（年齡、性別、腫塊單發或多發、術中腫塊大小）。收集患者的手術石蠟組織標本，以4 μm 厚度進行連續切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色，同時采用免疫組織化學染色法Max VisionTM法檢測切片標本中VEGF和Ang-2 的表達水平，將磷酸鹽緩沖液作為一抗進行陰性對照，分析比較上述分子標志物在PTC 組織和癌旁組織的表達和比較VEGF 和Ang-2 不同強度表達的臨床特征信息差異。

1.3 觀察指標免疫組織化學染色結果是采取雙盲法由2 位經病理科醫師指導后的研究員獨立閱片得出。用磷酸鹽緩沖液作為第一抗體進行陰性對照，VEGF 在免疫組織化學染色中的陽性標準主要表現為細胞胞質著色（淺黃色、棕黃色或棕褐色），見圖1。將染色結果表達水平為中等陽性（++）和強陽性（+++）定義為高表達。Ang-2 主要表現為細胞胞質著色（淺黃色、棕黃色或棕褐色），見圖2。參照免疫組化結果判讀方法標準，每張切片標本組織隨機選取5 個高倍視野（× 400），注意避開邊緣組織，進行陽性細胞計數并計算陽性細胞比例，結果取5 個高倍視野陽性細胞比例的平均值并進行評分（0 ～4 分），同時判斷染色強度并進行評分（0 ～3 分），最后以陽性細胞比例的評分值與染色強度的評分值的乘積來判斷VEGF 和Ang-2在切片標本組織中的表達水平。

圖1 VEGF 在兩組中的陽性染色（×200）Fig.1 The positive plasma staining of VEGF（×200）

圖2 Ang-2 在兩組中陽性染色（×200）Fig.2 The positive plasma staining of Ang-2（×200）

1.4 統計學方法采用SPSS 20.0統計軟件分析數據。計數資料以例數和百分數表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VEGF 在癌旁正常甲狀腺組織和PCT 組織的表達VEGF 在癌旁甲狀腺組織和PTC 組織呈高表達（++、+++）的比例分別為26.7%和71.3%，兩組差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。不同性別、年齡、腫瘤數量以及直徑大小的患者VEGF 表達比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表1 VEGF 在兩組的表達水平Tab.1 Immunohistochemical results of VEGF in adjacent tissues and PTC

2.2 Ang-2 在癌旁正常甲狀腺組織和PCT 組織的表達Ang-2 在癌旁甲狀腺組織和PTC 組織呈高表達（++、+++）的比例分別為31.4%和66.3%。兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。不同性別、年齡、腫瘤數量以及直徑大小的患者Ang-2表達比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表2 Ang-2 在兩組的表達水平Tab.2 Immunohistochemical results of Ang-2 in para-carcinoma tissuesand PTC

表3 VEGF 和Ang-2 在PTC 中表達與臨床病理參數間的關系Tab.3 Correlation between the expression of VEGF and Ang-2 in PTC and clinicopathological parameters

3 討論

VEGF 可強烈促使血管內皮細胞進行有絲分裂，是一種調控血管形成的細胞因子，在促進血管內皮細胞增殖、遷移和誘導血管形成中發揮著重要作用，目前被認為是促進惡性腫瘤血管形成的最強細胞因子［6］。VEGF 家族是由6 個有共同受體的半胱氨酸殘基組成的生長因子，包括VEGF-A、B、C、D、E 及胎盤生長因子（placental growth factor，PGF）［7］。其中，VEGF-A 在調節表皮細胞促進血管生長過程中發揮最重要的功能；VEGF-B 在非新生血管形成的腫瘤中起作用；VEGFC 和VEGF-D 是特異性淋巴管生成因子，與淋巴結轉移密切相關；VEGF-E 是一種潛在的新生血管形成因子；PGF 在實驗性脈絡膜新生血管中的表達較高，促進新生血管形成。膽管癌組織中VEGF 蛋白高表達，并與腫瘤分化、血管侵犯、神經浸潤、淋巴結轉移及臨床TNM 分期有關，提示VEGF 在惡性腫瘤侵襲轉移中起重要作用［8］。國內外學者對甲狀腺結節性病變和PTC 組織進行研究，結果顯示VEGF 在兩種疾病中的表達無顯著性差異［9-10］。HUANG 等［11］和JANG 等［12］研究發現VEGF 在已并發頸部淋巴結轉移的PTC 組織表達高于未并發頸部淋巴結轉移的PTC 組織，表明VEGF 的高表達與PTC 并發頸部淋巴結轉移有關。本研究中VEGF 表達水平在PTC組織中較正常甲狀腺腫組織中增高，提示VEGF 對于診斷PTC 有較好的臨床意義，有望成為診斷分子及治療靶點。并發與未并發頸部淋巴結轉移患者VEGF 的表達水平差異無統計學意義。分析可能的原因為本研究通過免疫組化方法檢測VEGF表達，但未能明確家族中不同功能亞型的具體表達水平，各亞型在PTC 是否伴有淋巴結轉移的臨

床意義可待后續的研究進一步求證。

Ang 家族作為血管和淋巴管形成的調節因子而受到越來越多的關注，其中Ang-1 和Ang-2 具有較好的特征性。Ang-1 廣泛表達于成人組織，具有促進血管成熟和穩定的作用，與之相反，Ang-2 的表達多發生在血管內膜去穩定化和血管重建的過程，如炎癥、腫瘤等病理狀態［13-14］。毛海波等［15］研究表明結腸癌患者血清中Ang-2 明顯增高，且與術后早期復發轉移及不良生存預后相關。KANG等［16］發現Ang-1 的高表達與腫瘤大小＞1 cm、包膜侵犯、甲狀旁腺外擴張、淋巴血管浸潤、淋巴結轉移和復發呈正相關，是淋巴結轉移和淋巴血管浸潤的獨立危險因素，但Ang-2 與臨床病理特征無明顯相關性。相反，HSUEH 等［17］通過免疫組織化學染色方法對Ang-2 的表達水平與PTC 臨床分期的關系進行探討，發現Ang-2 在已并發頸部淋巴結轉移的PTC 組織表達高于未并發頸部淋巴結轉移的PTC 組織。本研究結果顯示Ang-2 的表達水平較正常甲狀腺腫組織中增高，但其表達高低和是否合并有淋巴結轉移并沒有相關性，提示Ang-2 對診斷PTC 有一定的臨床意義。同時本研究發現，不同性別、年齡、腫瘤數量以及腫塊大小的PTC 患者VEGF、Ang-2 表達差異無統計學意義，和上述部分研究中并不相一致。本研究團隊在后續研究中有條件可以進一步擴大樣本量進行佐證。

綜上所述，VEGF 和Ang-2 對于PTC 的預測有較好的臨床意義，有望成為診斷的分子標記物及治療靶點，可以開展更深入的分子機制研究。尚未發現VEGF 和Ang-2 對PTC 是否伴有淋巴結轉移預測的診斷價值。