四個不同產區釀酒葡萄果皮微生物多樣性的研究

趙昱,李靜媛,解萬翠,趙宏偉*

1(青島科技大學 海洋科學與生物工程學院,山東 青島,266045) 2(青島農業大學 食品科學與工程學院,山東 青島,266109)

葡萄酒自然發酵過程中微生物因葡萄園管理、土壤類型、光照、降水量等自然因素的影響而存在顯著差異[1-3],導致不同產區葡萄酒口感、風味不同。國內對釀酒葡萄表皮微生物的研究日益增多[2,4-6]。高通量測序技術又稱下一代測序(next-generation sequencing,NGS)技術,是目前應用最普遍的測序技術,對微生物的群落結構分析具有獨特的優勢[7],一次可以對十幾萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定,克服了傳統培養技術及分子鑒定方法的缺陷,可為微生物群落組成提供更準確和詳細的分析,并在改善微生物資源開發和食品安全方面作出了巨大的貢獻。

目前,相較于國際上著名葡萄酒產地微生物的研究而言,我國雖然葡萄栽培區域廣闊,但對于不同產區葡萄表面微生物群落的分析研究一直處于空白。隨著中國葡萄酒產業的發展,探究不同產區釀酒葡萄表皮微生物的多樣性,對選育產區特色發酵菌株,提升中國葡萄酒的品質及國際影響力具有深遠意義。本研究利用NGS技術對比研究了寧夏賀蘭山、河北懷來、山東蓬萊、山東青島4個產區赤霞珠葡萄表皮微生物的組成和多樣性,以期為我國著名產區釀酒微生物資源庫的建設以及提高葡萄酒品質等方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄：寧夏賀蘭山(nxcs)、山東蓬萊(plcs)、山東青島(qdcs)、河北懷來(hbcs) 產區葡萄園中的赤霞珠(Cabernet Sauvignon) 釀酒葡萄品種,樣品分別于2019年9月采樣。從1株葡萄樹的上、中、下3個部位采樣。

聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、氯化鈉及其他試劑均為分析純。

TENP緩沖液：50 mmol/L的Tris,20 mmol/L的EDTA,100 mmol/L的氯化鈉,0.01 g/mL的PVP(pH 10),調pH至10。

磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS,pH7.4)：在800 mL蒸餾水中溶解8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4,用HCl溶液調節溶液的pH值至7.4,加水定容至1 L,在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。保存于室溫,待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理[8]

(1)樣品由于自然環境,葡萄表面復雜成分的影響,在微生物總DNA提取前需要對樣品進行預處理,分離多糖、色素、多酚類等雜質。取適量葡萄原料,在無菌條件下將葡萄果皮取下,準確稱取不同產區的釀酒葡萄果皮8 g,分別加入到50 mL無菌離心管中并標記A,加入12 mL TENP緩沖液,渦旋振蕩5 min后3 000×g離心5 min,轉移上清液至新的離心管中并標記B。(2)吸取12 mL TENP緩沖液到離心管A,渦旋振蕩5 min,3 000×g離心5 min后轉移上清液至離心管B中。(3)在離心管A中加入6 mL PBS溶液,渦旋振蕩5 min,3 000×g離心5 min,轉移上清液至離心管B中,將離心管B以9 000×g離心10 min,棄去上清液,沉淀物于-20 ℃保存備用。

1.2.2 DNA的提取

釀酒葡萄表皮微生物DNA采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒進行提取。

1.2.3 樣品PCR

第一輪擴增前利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量,以確定PCR反應體系中應加入的 DNA量。真菌DNA進行PCR所用引物是已經融合了測序平臺的通用引物ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)；細菌DNA 進行PCR所用的引物為測序通用引物Nobar_341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和Nobar_805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。

取2×Hieff?Robust PCR 預混液15 μL、正向測序引物和反向測序引物各1 μL、10～20 ng模板DNA、9～12 μL H2O,配制總體積為30 μL的 PCR反應體系。PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s,45 ℃退火20 s,65 ℃延伸30 s,反應5個循環；94 ℃變性20 s,55 ℃ 退火20 s,72 ℃延伸30 s,反應20個循環；72 ℃延伸5 min。

對第一輪PCR擴增質檢合格的產物進行第二輪Illumina橋式PCR,用于測序文庫的構建,反應體系為：15 μL 2×Hieff?Robust PCR預混液、1 μL Index-PCR Primer F、1 μL Index-PCR Primer R、20～30 ng PCR 擴增產物、9～12 μL H2O,總體積為30 μL。

擴增樣品振蕩混勻后短暫離心將反應液離心至管底。將PCR管置于PCR儀中進行擴增,PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s,55 ℃ 退火20 s,72 ℃延伸30 s,反應5個循環；72 ℃延伸 5 min,得到的產物于-20 ℃保存備用。

1.2.4 高通量測序[9]

PCR擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行真菌ITS序列的ITS1-ITS2區間、細菌16S rRNA基因 V3-V4區域文庫的構建,之后應用Illumina Misq測序平臺進行分析。

1.3 數據預處理

將測序得到的原始數據進行預處理,過濾去除引物和接頭序列、非特異性擴增序列及嵌合體,以保證最終用于操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)分析的數據質量可靠。

1.4 數據分析

1.4.1 OTU聚類分析

采用Usearch軟件,將所有樣本序列按照序列間的距離進行聚類,后根據序列之間的相似性將序列分成不同的OTU。通常在低于97%的相似水平的OTU進行生物信息統計分析。

在OTU聚類結果的基礎上,獲取每1個OTU聚類中的代表性序列。選擇豐富度最高的序列作為代表性序列,使用R軟件的VennDiagram package數據包繪制韋恩圖。

1.4.2 Alpha多樣性分析

通過對樣品的多樣性分析能夠反映微生物群落的豐度和多樣性,主要包括Chao1、Shannon和Simpson；并通過計算Coverage指標檢測各樣品文庫的覆蓋率,其數值越高,則樣本中序列沒有測出結果的概率越低,反映本次測序結果具有代表性。

1.4.3 微生物分類及差異性分析

對OTU數據進行整理,在門、屬的水平上對各個樣本中的真菌、細菌進行物種豐度柱形圖統計,分析每一個樣本物種占比并對優勢菌屬進行分析,通0.01 g/mL過主坐標分析圖及聚類圖分析樣本間相似度。

2 結果與分析

2.1 稀疏曲線

稀疏曲線用于比較不同測序數據量的樣本中物種的豐富度,同時可以說明樣本的測序數據量是否合理。當曲線趨向平坦時,說明測序數據量合理,增大數據量只會產生少量新的OTU,反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU。如圖1顯示,細菌樣品的OTU稀疏曲線在小于12 000個序列、真菌樣品的OTU稀疏曲線在小于60 000個序列的條件下均沒有進入平臺期,繼續增加測序量,其OTU數量也會隨著增加。但隨著測序量的增加,細菌、真菌的Shannon指數稀疏曲線在測序量到達一定數值之后趨于平穩進入平臺期。由此可知,隨著測序量的增加有可能會發現新的微生物種類,但微生物多樣性已經不再隨測序量的增加而發生變化,說明測序數量足夠充分合理。因此,本研究中細菌、真菌的測序量滿足后續的生物信息學分析。

a-細菌群落OTU稀疏曲線；b-細菌群落Shannon指數稀疏曲線；c-真菌群落OTU稀疏曲線；d-S真菌群落hannon指數稀疏曲線圖1 OTU稀疏曲線和Shannon指數稀疏曲線Fig.1 OTU sparse curve and Shannon exponential sparse curve

2.2 樣品中所含OTU數目分析

由圖2可知,共檢測到2 364個細菌OTU,其中,寧夏賀蘭山、山東蓬萊、河北懷來和山東青島產區的赤霞珠表皮細菌種類分別為531、666、626、541種；上述4個產區中特有的細菌種類分別為422、523、481、463種,共有的細菌種類有38種。由此可知,4個產區中葡萄樣品中細菌菌群結構差異明顯,其中山東蓬萊赤霞珠葡萄表皮細菌菌種最為豐富。另外,山東蓬萊和河北懷來產區的赤霞珠果實表面共有的OTU數目有117個,遠高于其他產區間的共有細菌菌種數,說明山東蓬萊與河北懷來赤霞珠表皮細菌種類相似度較大。

由圖3所示,共檢測到2 007個真菌OTU,其中,寧夏賀蘭山、山東蓬萊、河北懷來和山東青島產區的赤霞珠表皮真菌種類分別為460、567、504、476個；上述4個產區特有真菌種類分別為403、505、446、424個,共有的真菌種類有12個。由此可知,4個產區赤霞珠表皮真菌種類總數相差不大,但真菌群落結構差異較大。

圖3 真菌群落韋恩圖Fig.3 Venn diagram of fungal community

2.3 細菌和真菌群落多樣性分析

由表1可知,經測序后4個產區有效序列數分別為hbcs 10 698條、nxcs 7 846條、plcs 9 828條和qdcs 10 747條,并且所有樣品Coverage指數覆蓋率達到95%～97%,說明所測的OTU數基本能反映樣品的真實情況。Shannon值越大,說明微生物的多樣性越高,其中河北懷來赤霞珠表皮微生物的Shannon指數最大(4.18),青島樣品的Shannon指數最小(3.15),證實河北懷來赤霞珠葡萄表皮的細菌微生物多樣性最高,而青島產區的多樣性最小。Chao1用來估計物種總數,由數據可知,hbcs、nxcs、plcs、qdcs的數值分別為4 934、5 460、7 979和9 902,表明河北懷來赤霞珠表皮細菌包含的物種總數最少,青島赤霞珠表皮細菌總數最多。Simpson指數也是表征樣品微生物多樣性的指標,數值越大,反而多樣性越低,表1數據顯示河北懷來葡萄樣品的Simpson指數最小,其余3個產區的樣品Simpson指數沒有顯著差異(P<0.05),再次驗證河北懷來葡萄表面微生物多樣性顯著高于其他3個產區。

表1 細菌群落Alpha多樣性指數Table 1 Alpha diversity index of bacterial community

真菌菌群Alpha多樣性分析結果如表2所示,測序數據經過質控、過濾后,各產區樣品得到的有效序列數分別為38 019(nxcs)、55 957(plcs)、53 676(qdcs)、47 464(hbcs),且4個產區Coverage指數的覆蓋率都高達99%以上,說明所測的OTU數基本能反映樣品的真實情況。其中,河北懷來產區樣品的Shannon指數值最大(3.40),Simpson指數最小(0.07),且Chao1指數值亦最大(6 596),說明河北懷來赤霞珠表皮真菌微生物豐富度最大且微生物物種總數最多；而青島地區赤霞珠葡萄表皮微生物菌群的Shannon指數數值最小(2.17)且Simpson 指數為0.30,說明山東青島赤霞珠表皮真菌微生物豐富度最小；寧夏賀蘭山產區樣品的Shannon指數為2.64,但Chao1僅為4 744,說明該地區的赤霞珠葡萄真菌多樣性較為豐富,但所含微生物總數較其他產區要少。

表2 真菌群落Alpha多樣性指數Table 2 Alpha diversity index of fungal community

綜上所述,由Alpha多樣性指數分析可知,河北懷來赤霞珠表皮微生物多樣性最為豐富且所含真菌微生物數量最多；山東青島赤霞珠表皮的細菌總數最多但微生物多樣性卻最低；寧夏賀蘭山地區的赤霞珠葡萄真菌多樣性較為豐富,但葡萄表面所含的微生物總數較少。

2.4 微生物豐度分析

2.4.1 細菌豐度

由于從樣品中檢測出的細菌種類高達200多種。為了便于統計,本研究將物種的豐度大于1%作為劃分依據,在屬水平上選擇了排名前20的優勢細菌。由圖4-a可知,除去未分類的菌屬,苯基桿菌屬(Phenylobacterium)為河北懷來、山東青島、寧夏賀蘭山產區赤霞珠表皮菌群中含量最高的優勢細菌屬,相對豐度分別為6%、15%、11%。苯基桿菌屬細菌屬于典型的土壤微生物,其特征為營養譜單一,不能利用大多數糖、醇,可降解除草劑Pyramin?中的成效成分氯吡嗪(Chloridazon)[10]。上述3個產區的葡萄園中有機農藥的使用可能較為頻繁,經過長期的自然選擇造就了苯基桿菌屬這一優勢細菌屬。而從蓬萊地區樣品檢測到的優勢的菌屬為勞爾氏菌屬(Ralstonia),相對豐度為8%。該菌能夠導致番茄、煙草、桑樹等植物枯萎死亡,俗稱“青枯病”[11]。噬幾丁質菌屬(Chitinophaga)在4個產區的葡萄表面細菌群中大量存在,該菌屬為一種土壤微生物,有利于植物固氮[12]。不動桿菌屬(Acinetobacter)是一類異養硝化細菌,具有較強的脫氮能力,其只在河北懷來的葡萄樣品中大量存在,其他3個產區幾乎檢測不到。這是由于河北懷來近幾年為促進葡萄產業發展,推廣了一系列促早優質栽培技術,使用含氮磷鉀肥料較多,從而促進了該菌屬的生長[13]。總體而言,4個產區的葡萄樣品中細菌微生物菌群結構相差不大,但特定菌屬的相對豐度差異較大,這與氣候、田間管理有直接關系[3]。

在“門”水平上,將物種的豐度大于1%作為劃分依據,選擇排名前7的優勢細菌進行分析。由圖4-b可知,變形菌門(Proteobacteria)在4個產區的赤霞珠葡萄表皮上均檢測到,且豐度在各樣品中均最高(約50%～70%)。此外,擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)在4個產區也均可檢出。由此可見,4個產區優勢菌種在門水平上依舊相差不大,而相對豐度有一定差異,與前面細菌屬水平的結果保持一致。張世偉[14]研究表明,釀酒葡萄表面的優勢菌門有變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes),本實驗結果與其大致相同。相關研究表明,厚壁菌門中大部分細菌屬于發酵型細菌,擬桿菌門是一類具有碳水化合物發酵等諸多功能的菌群[15]。綠彎菌門是一類利用CO2,通過光合作用產生能量的細菌,這種菌在有機質含量較低的土壤中很有優勢[16]。本實驗中河北懷來赤霞珠表皮中綠彎菌門相比于其他產區含量較高,可能是因為河北多沙質土壤,有機質含量低。

a-屬水平;b-門水平圖4 細菌群落屬水平和門水平相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria community at genus and phylum level

2.4.2 真菌豐度

從樣品中檢測出的真菌種類繁多,為了便于統計,本研究將物種的豐度大于1%作為劃分依據,選擇排名前18的優勢真菌屬進行分析。由圖5-a可知,在屬水平4個產區赤霞珠葡萄表皮的真菌菌群結構存在一定的差異。寧夏賀蘭山產區含量較高的優勢菌屬為短梗霉屬(Aureobasidium),相對豐度為44%。山東青島和蓬萊產區含量較高的短梗霉屬(Aureobasidium)和紅酵母屬(Rhodotorula),相對豐度之和達到60%。河北懷來產區葡萄表皮真菌菌群結構最為復雜,且各真菌微生物的豐度分布較平均。魏玉潔等[2]利用高通量測序的方法發現葡萄果實和葉片中最豐富的真菌屬為短梗霉屬,這與本文的研究結果一致。目前,已報到與葡萄酒相關的酵母菌中紅酵母屬(Rhodotorula)容易在未成熟的漿果表面產生[17]。釀酒酵母屬(Saccharomyces)的微生物在4個產區的樣品中均出現,但相對豐度并不高,說明葡萄果皮并非釀酒酵母屬菌株良好的生活環境。

a-屬水平;b-門水平圖5 真菌群落屬水平和門水平相對豐度Fig.5 Relative abundance of fungal community at genus and phylum level

圖5-b顯示,將物種豐度大于1%作為劃分依據,4個產區最具有優勢的菌門為子囊菌門(Ascomycota),寧夏賀蘭山、山東青島、蓬萊和河北懷來的相對含量分別為59%、68%、88%、70%。其次,擔子菌門(Basidiomycota)在4個產區的菌群中含量亦較高。研究表明,子囊菌門和擔子菌門中的微生物均為土壤中的優勢菌種,能夠分解大多數有機物質和植物殘骸[18],這與本文的研究結果一致。另外,本研究發現部分真菌菌門獨立存在于特定產區,如在青島樣品中檢測出特有的絲竹蟲門(Cercozoa)；河北懷來產區樣品中檢測到特有的球囊菌門(Glomeromycota),這可能與河北產區的砂質土壤有關。被孢霉門(Mortierellomycota)未在蓬萊產區樣品檢出,其他3個產區的葡萄表皮樣品上均檢測到。由此說明在以上4個產區中的葡萄果實上優勢真菌群落結構在菌門水平差異不大但相對豐度有明顯差異。

2.5 微生物群落結構相似性分析

對4個產區的釀酒葡萄果皮上細菌群落進行基于OTU的主成分分析(principal component analysis,PCA),樣本間相似度越高則在圖中表現出越聚集。如圖6-a顯示,當PCA1為97%,PCA2為2%時,4個樣品點沒有重疊,說明4個產區葡萄皮細菌菌群結構具有一定的差異性。其中,通過各產區樣品在PCA1上的分布來看,蓬萊、青島2個產區的樣本距離更為接近,均與寧夏、河北產區的樣本相距較遠,尤其是與河北產區的樣品之間的距離差異最為明顯,這說明4個產區中山東青島、蓬萊的菌群結構較為相似,均與寧夏賀蘭山、河北產區的葡萄在細菌群落結構上差異較明顯。

a-主成分分析圖；b-聚類分析圖圖6 基于OTU的細菌群落主成分分析圖和聚類分析圖Fig.6 OTU-based principal component analysisand cluster analysis of bacterial community

樣本聚類樹圖可以通過樹枝結構反映出多個樣品間的相似性和差異關系。對4個產區細菌群落進行了基于OTU的聚類分析,如圖6-b所示。聚類樹圖樹枝的長度代表樣本間的距離,越相似的樣本會越靠近,圖中同一顏色的樹枝代表來源于同一組。結果顯示,4個樣品共聚為三大支,山東青島和蓬萊產區2個樣本歸為一類,河北懷來、寧夏賀蘭山產區的樣品各另聚為一類。說明4個產區赤霞珠表皮微生物除部分差異微生物群落外,山東青島赤霞珠和山東蓬萊赤霞珠表皮在微生物群落上更為相似,差異較小。寧夏賀蘭山產區葡萄表皮微生物群落組成與山東產區樣品差異較大,這與PCA結果基本一致。

真菌群落PCA結果如圖7-a所示,當PCA1為76%,PCA2為18%時,4個樣品點沒有重疊,有明顯差距,說明4個產區葡萄皮真菌菌群結構存在一定的差異性；從PCA1上各樣品點的分布來看,4個產區距離分別都較為接近,說明山東青島與蓬萊產區、河北懷來與寧夏賀蘭山產區的葡萄果皮上大部分真菌微生物相似性較高。同細菌聚類分析的結果類似,如圖7-b所示,山東蓬萊、青島產區的樣本中真菌菌群結構聚為一類,說明山東青島和蓬萊2個地區的葡萄果實上的微生物群落結構差異不明顯,這可能與空間距離、氣候特征有直接關系。

a-主成分分析圖；b-聚類分析圖圖7 基于OTU的真菌群落主成分分析圖和聚類分析圖Fig.7 OTU-based principal component analysis and cluster analysis of fungal community

綜上,山東蓬萊、山東青島的赤霞珠果實表皮微生物的菌群結構較為相似；河北懷來和寧夏賀蘭山產區的葡萄樣品菌群結構與山東兩地的有一定差異,分別各聚為一類。研究表明,釀酒葡萄表皮細菌群落多樣性受葡萄園土壤微生物群落的影響[14]。山東蓬萊和山東青島產區大多為棕壤土,河北懷來土壤為褐土,質地偏砂,寧夏賀蘭山土壤以灰鈣土為主,疏松多孔。因此,4個產區葡萄表皮微生物菌群結構的不同與各產區不同的土壤條件密切相關。

3 討論

LEVEAU等[19]發現，霞多麗葡萄上53.5% 的細菌為變形菌門,其他主要有厚壁菌門(15.1%)、擬桿菌門(10.1%)和放線菌門(Actinobacteria,8.0%);MARTINS等[20]發現美樂葡萄上的優勢細菌也主要歸屬于變形菌門。而本研究通過高通量測序分析寧夏賀蘭山、河北懷來、山東蓬萊、山東青島產區的赤霞珠表皮微生物的群落結構及多樣性,檢測到優勢細菌門有變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和綠彎菌門(Chloroflexi)。通過文獻對比發現,雖然葡萄品種、所屬地區不同,但葡萄果實表面的優勢菌種在門水平的分布基本一致。在屬水平,苯基桿菌屬(Phenylobacterium)為河北懷來、山東青島、寧夏賀蘭山產區赤霞珠表皮上的優勢細菌菌種。而蓬萊地區樣品檢測到的最優勢菌屬為勞爾氏菌屬(Ralstonia)。

葡萄酒釀造相關細菌主要為乳酸菌,起到將蘋果酸轉化為乳酸的作用,如檢測到的明串珠菌屬(Leuconostoc)[21]。另外,本研究檢測到的厚壁菌門的微生物,發生蘋果酸-乳酸發酵后可以有效地降低葡萄酒酸度,避免葡萄酒在裝瓶、貯存期間發生二次發酵,增加葡萄酒的微生物學穩定性,從而影響葡萄酒的感官品質。除此之外,大多數細菌微生物對于葡萄酒來說都屬于有害菌,會在不同程度上對葡萄酒的品質造成影響,例如檢測到的變形菌門(Proteobacteria),是葡萄酒釀造中典型的有害菌[22],導致葡萄酒變質。

4個產區的葡萄表皮微生物共檢測到11種真菌菌門,其中優勢菌門為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)。在屬水平4個產區的真菌菌群結構有一定的差異。寧夏賀蘭山產區優勢菌屬為短梗霉屬(Aureobasidium)；山東青島和蓬萊產區含量較高的2個真菌屬為短梗霉屬(Aureobasidium)和紅酵母屬(Rhodotorula)。BOKULICH等[23]研究發現增芳德葡萄表面上的優勢真菌屬為假絲酵母(Candidazemplinina),與本文的研究結果相差較大,可能由于葡萄的栽培方式不同造成。

本研究4個產區的樣品中均檢測到霉菌,霉菌是一種絲狀真菌,通過侵染葡萄的莖、葉、花、果實等影響果實品質。發酵過程若霉菌侵染會產生霉味,造成葡萄酒病害。有研究指出由曲霉屬(Aspergillus)產生的赭曲霉素是全球葡萄酒都存在的問題[24],但其存在于葡萄酒中的可能性風險不高,在本研究中僅在河北懷來產區的葡萄表面檢出該菌屬。酵母菌是葡萄酒釀造的主體,決定葡萄酒的品質,本研究檢測到Saccharomyces、Pichia、Candida、Hanseniaspora、Dekkera、Rhodotorula這6個菌屬的菌株,其中,Saccharomyces是酒精發酵的主要完成者,將葡萄中的糖轉化成乙醇、CO2及其他代謝產物[25]。

4 結論

本試驗通過對我國中、東部地區4個產地赤霞珠葡萄表面微生物多樣性進行研究,發現在門水平,4個區域葡萄果皮上的優勢細菌均屬于變形菌門(Proteobacteria),優勢真菌為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)。在屬水平上,河北懷來、山東青島和寧夏賀蘭山產區的葡萄樣品上的優勢細菌為苯基桿菌屬(Phenylobacterium)；山東蓬萊產區優勢菌屬為勞爾氏菌屬(Ralstonia),寧夏賀蘭山地區葡萄的優勢真菌為短梗霉屬(Aureobasidium),而山東青島和蓬萊地區豐度較高的真菌屬于短梗霉屬和紅酵母屬(Rhodotorula)。結果證實產區是影響葡萄表皮微生物菌群結構的重要因素之一,這可能與氣候條件、土壤類型等因素有關。