南美白對蝦酶促剝殼工藝優化及其對蝦仁品質的影響

楊肖杰,黃卉,李來好,楊賢慶,趙永強,岑劍偉,郝淑賢*

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306) 2(中國水產科學研究院南海水產研究所,農業農村部水產品加工重點實驗室,國家水產品加工技術研發中心,廣東 廣州,510300)

南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)富含蛋白質、纖維素、礦物質元素、維生素和多種對人體有益的氨基酸，肉質鮮美，營養價值高，深受廣大消費者喜愛[1-2]。去殼蝦仁是蝦加工的主要產品，但外殼通過表皮內纖維緊密地附著在表皮上，同時表皮內纖維通過微管相互交叉牢固地連接在肌肉上[3]，使得鮮蝦殼難以剝離。因此，剝殼前需進行預處理使殼肉間的緊密連接松動。常用的殼肉松動方法是速凍后進行解凍再剝殼或采用超高壓技術，但都易造成蝦仁品質劣變，限制了其產業化應用[4]。

近年來，常用酶解蝦殼或蝦頭來回收蛋白質，或得到富含多肽的酶解產物[5-7]。羅春燕等[8]通過響應面法優化了魷魚須胰酶脫皮的工藝參數，得到的樣品白度值較好，原料保留率高，且質構特性與肌纖維組織均無顯著變化；DANG等[10]報道了Endocut-03L和Exocut-A0復合蛋白酶促進凍蝦(Pandalusborealis)剝殼的效果，蝦殼和表皮的大分子蛋白質降解破壞殼肉連接，是酶法便捷剝殼的主要原因[11]。但關于酶法預處理促進鮮蝦便捷剝殼的研究及其對蝦肉品質的影響則鮮有報道。本研究以鮮活南美白對蝦為原料，基于質構儀以剝殼單位功為響應值，優化酶促剝殼的工藝參數；并探討酶法前處理對蝦仁品質的影響，為機械剝殼的產業應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活南美白對蝦,于2019年8～10月購于廣州超市,蝦體規格長11～13 cm,20 min內運往實驗室。固定液：4%(質量分數)多聚甲醛 0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.3)、中性蛋白酶(≥200 U/mg)、堿性蛋白酶(≥200 U/mg)、風味蛋白酶(≥15 U/mg)和動物蛋白水解酶(≥90 U/mg),博美生物技術有限公司；中性蛋白酶活性測定試劑盒,北京索萊寶科技有限公司；NaCl為食品級,其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

QTS-25質構儀,英國CNS FARNEL有限公司；IKA-T25組織勻漿機,德國IKA公司；CR-400色差計,日本KONICA MINOLTA公司；3K30臺式高速冷凍離心機,德國Sigma公司；Sunrise-basic吸光酶標儀,德國 TECAN 公司；BX53顯微鏡,日本OLYMPUS。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的處理

鮮蝦洗凈,加冰猝死,去除蝦頭、蝦足,放入自封袋備用[9]。酶處理過程如下:以20 g/L的標準鹽水溶液配制不同質量濃度的酶溶液,取酶液倒入燒杯中,放入12只蝦(3節蝦身),約(50±5)g,完全浸沒。為保證酶液的均勻分布和蝦肉品質,以280 r/min的速度攪拌,酶液的溫度為(5±2) ℃,直至剝殼。取出樣品,濾去多余的水分,稱重并記錄質量(m)。一批置于-20 ℃冰箱中冷凍24 h,流水解凍后剝殼。以冷凍24 h后脫殼的蝦仁和新鮮蝦仁為對照,對酶促剝殼的蝦肉品質進行評價。

1.3.2 剝殼效果測定

參考YANG等[11]的方法,如圖1所示用質構儀分析蝦體剝殼效果。將頂部探針穿過蝦體背部殼肉之間(圖1-b),底部基座上的針插入蝦身肌肉中間(圖1-c),進行張力測試,同時將殼從蝦體剝離(圖1-d),測定條件：測試速度 2.5 mm/s;目標距離 60 mm;觸發力5.0 g。剝殼后,分為完全剝殼的蝦(蝦殼完全剝掉)和未完全剝殼的蝦(蝦殼沒有剝掉或有部分破碎蝦殼粘連在肉上),只有完全剝殼的蝦用于計算蝦的剝殼用功,記為剝殼單位功(mJ/g,下同)。

圖1 剝殼方法及過程Fig.1 The method and procession of shrimp peeling

1.3.3 蛋白酶的篩選

選取中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶和動物蛋白水解酶,為保證酶液的作用活性一致,酶添加量分別為0.500、0.500、6.667、1.111 g/500 mL,自然pH值,樣品與酶液之比為1∶10(g∶mL),酶液的溫度為(5±2) ℃,酶解時間2 h。對照處理采用20 g/L標準鹽水浸泡。

1.3.4 單因素試驗

在酶處理溫度(5±2) ℃，自然pH下,分別研究不同質量濃度的酶液(0.25、0.5、0.75和1.00 mg/mL)、酶解時間(1、2、3、4和5 h)和料液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和1∶12,g∶mL)對蝦體剝殼單位功的影響。

1.3.5 響應面優化

根據單因素試驗結果,選取酶解時間(A)、酶質量濃度(B)、料液比(C)為響應因素,以剝殼單位功(mJ/g)為響應值,實驗因素及水平見表1。

表1 響應面實驗的因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.3.6 酶液的重復利用

為探究酶液的重復利用問題,每輪實驗結束后,取出3節蝦身,測定剝殼單位功,同時測定酶活性(初始和每輪處理后酶活性)和酶液的顏色。中性酶活性的測定采用中性酶活性檢測試劑盒,每組測2次,結果用U/mL表示。

1.3.7 蝦肉品質測定

pH值:參考GB 5009.237—2016《國家食品安全標準 食品中pH值的測定方法》。每組取5 g蝦肉,加入45 mL蒸餾水,充分均質后,靜置30 min過濾,取濾液測pH值,平行3次。

色澤的測定:根據XU等[12]的方法,測量蝦仁第2節腹側的L*、a*、b*值。每組6個平行,色差計事先用標準白板校正。

質構特性的測定:參考LI等[13]方法對蝦仁第2腹節做質地多面分析(texture profile analysis,TPA)測試。將樣品置于平臺上,用直徑為4 mm的TA44圓柱形探頭進行兩循環咀嚼試驗,軸向壓縮距離(應變)：5 mm；觸發力,5 g；恒速測試,1.0 mm/s；返回速度為1.0 mm/s。獲取硬度(N)、彈性(mm)、咀嚼性和內聚性等TPA參數。每組樣品8個平行。

肌肉組織微觀結構:參考LIN等[14]的方法,取蝦第1腹節肌肉切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊。4 ℃條件下固定24 h,梯度乙醇(30%、50%、70%、90%和100%)脫水,用二甲苯浸泡至透明后浸蠟,切片(橫截面和縱截面)。將切片平貼于載玻片上,烘干后進行蘇木精和伊紅染色,光學顯微鏡下觀察其肌肉組織微觀結構并拍照。

1.4 數據分析

使用SPSS Statistics 22.0對數據進行統計分析,每組處理3次平行,結果為均值±標準差(SD)。以one-way ANOVA法及 Duncan 檢驗對實驗數據進行組間比較和差異顯著性分析,顯著性水平定義為P<0.05。

2 結果與討論

2.1 蛋白酶篩選結果

所用4種酶的適宜pH范圍均在6.5～8.0之間[15-16],考慮到pH對蝦肉品質的影響,選擇自然pH,不同蛋白酶預處理后所需剝殼單位功如圖2所示。加酶處理能促進蝦剝殼,特別是中性蛋白酶,剝殼所用功為2.14 mJ/g,明顯低于對照和其他3種蛋白酶處理組(P<0.05)。中性蛋白酶是自然pH條件下具有很強活力的內切酶,可催化殼、表皮及殼肉連接的蛋白質肽鍵水解且催化反應速度快,破壞殼-肉之間的連接[9]。結合經濟成本,選用中性蛋白酶對酶處理輔助剝殼工藝進行優化。

1-對照;2-風味蛋白酶;3-動物蛋白水解酶;4-堿性蛋白酶;5-中性蛋白酶圖2 不同蛋白酶對剝殼單位功的影響Fig.2 Effect of different proteases on the peeling work注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酶質量濃度對剝殼的影響

中性蛋白酶的質量濃度對蝦體剝殼的影響如圖3所示,質量濃度從0.25 mg/mL增加到1 mg/mL時,剝殼所需單位功由6.24 mJ/g降低至1.37 mJ/g。說明隨著質量濃度的增加,單位體積內蛋白酶與蝦殼、表皮及殼肉連接的蛋白質的接觸機會增加,水解作用增強[17],殼肉之間的緊密連接發生松動,剝殼所需的功減小。當質量濃度超過0.5 mg/mL時,剝殼用功下降幅度減弱；質量濃度為1 mg/mL時,剝殼用功雖然減少(P<0.05),但實驗中觀察到蝦殼變脆弱,蝦殼是否完全剝掉,不僅依賴于殼肉連接的緊密性,而且與蝦殼的性質相關[9],酶解過度會使蝦殼的強度降低,剝殼時蝦殼易破碎,部分蝦殼仍留在蝦肉上,影響剝殼的完整性。綜合經濟效益考慮,確定合適的酶質量濃度為0.5 mg/mL。

圖3 酶的質量濃度對于剝殼單位功的影響Fig.3 Effect of concentrations of protease on the peeling work

2.2.2 酶解時間對剝殼的影響

如圖4所示,在2 h內,蝦剝殼單位功顯著減少(P<0.05),其剝殼單位功為4.21 mJ/g,隨著時間的延長,剝殼所需單位功差異不顯著(P>0.05)。初始酶液中的酶量相對較高,與底物的充分接觸,使蝦殼-肉間松動的增加幅度較大,隨著反應的進行,酶被消耗,酶活力開始下降,剝殼單位功的減小趨于平緩(P>0.05),與酶解時間對秘魯魷魚環齒的脫離的影響具有相似性[18],所以合適的酶解時間為2 h。

圖4 酶解時間對于蝦剝殼單位功的影響Fig.4 Effect of enzymalysis time on the peeling work

2.2.3 料液比對剝殼的影響

在酶質量濃度為0.5 mg/mL,處理時間為2 h的條件下,不同的料液比下對蝦剝殼影響如圖5所示,料液比為1∶2和1∶4(g∶mL)時,酶解對蝦殼-肉連接部分的作用有限,蝦殼基本不能完整地被剝除。此后,隨著料液比的減小,即酶液體積的增加,作用于樣品底物的酶量增加,酶解作用接觸位點增多,剝殼單位功減小,料液比超過1∶8時(g∶mL),剝殼用功差異不顯著(P>0.05),因此確定料液比為1∶8(g∶mL)。

圖5 料液比對蝦剝殼單位功的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio on the peeling work

2.3 響應面優化分析

2.3.1 實驗設計及結果

在單因素試驗的基礎上,利用響應面法對酶解時間(A)、中性蛋白酶的質量濃度(B)、料液比(C)進一步優化,采用 Box-Behnken 原理,以剝殼單位功(Y)為響應值設計實驗,根據 Design-Expert 10設計試驗方案,結果見表2。

表2 Box-Behnken優化設計及結果Table 2 Box-Behnken design and results

2.3.2 響應面模型的建立及方差分析

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3.3 響應曲面交互作用分析

由圖6可知,酶解時間(A)和酶質量濃度(B)交互作用的響應面坡度較陡,說明因素間的交互作用對剝殼單位功影響顯著,其等高線呈橢圓形,表示這2個因素間交互作用顯著；酶解時間(A)和料液比(C)、酶質量濃度(B)和料液比(C)交互作用的響應面坡度較平緩,其等高線呈圓形,說明AC、BC因素間的交互作用剝殼單位功影響較弱,分析結果與表3具有一致性。

圖6 各因素交互作用對剝殼單位功影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface and contour lines of interactions of various factors on the peeling work

2.3.4 模型的優化和驗證

根據響應面優化實驗的結果,結合實際生產中的操作和成本,確定的優化值為：處理時間3.5 h、酶質量濃度0.7 mg/mL、料液比1∶10(g∶mL),此時預測得到的剝殼單位功為2.61 mJ/g。為了驗證模型預測的準確性,用此優化條件重復試驗3次,實際得到的蝦剝殼單位功為2.65 mJ/g,非常接近該二次回歸模型的預測值(>0.05),充分驗證了模型的準確性,因此,采用Design-Expert 10響應面分析法優化得到的酶促脫殼條件參數準確可靠。

2.4 酶液的循環利用

酶液循環使用對剝殼單位功的影響如圖7所示。隨使用次數的增加,酶液活性呈下降趨勢,循環使用4次后,由初始的62.34 U/mL降為9.77 U/mL,而剝殼用功則由2.25 mJ/g增加為5.94 mJ/g,兩者的變化具有一致性；循環使用4次均無殼破碎粘連在蝦肉上,但循環使用3次后,酶液活性顯著下降至24.62 U/mL(P<0.05),剝殼單位功明顯增加。且隨循環使用次數增加,酶液顏色變黑,建議此酶液循環使用3次。

圖7 酶液循環使用輪數對酶活性和剝殼單位功的影響Fig.7 Effect of reusing of enzyme solution on proteolytic activity and peeling work

2.5 不同預處理剝殼對蝦仁品質的影響

2.5.1 pH值和色澤

蝦體死后,體內糖原降解影響肌肉pH值,所以通常把pH值作為判斷蝦體新鮮度的指標,且在pH值達到7.7前認為蝦肉質量良好[19]。鮮蝦死后pH值為6.88,這與XU等[12]測定的蝦初始pH值 6.92相似。與鮮蝦相比,冷凍和酶解處理后的蝦仁pH值分別為6.80和6.78,差異不顯著(P>0.05),說明酶解剝殼對蝦肉鮮度影響不明顯,且得到的蝦肉質量良好。色澤是影響消費者購買的主要因素[20]。冷凍和酶法剝殼處理可增加蝦仁L*,說明冷凍和酶處理均能增加蝦仁的亮度,這是由于冷凍-解凍過程中,肌肉組織細胞內形成的冰晶融化、水分溢出引起的光吸收和光散射的變化[21]；部分蝦仁表皮可能被酶解,同樣殘留在表面的酶液也增加了光的反射作用。酶法處理對a*和b*影響與鮮蝦無異,冷凍后的蝦仁表面b*值為-2.61,與對照相比顯著增加(P<0.05)。綜合來看,酶處理對色澤的影響較小,可能是因為其處理時間相對較短且蝦體無凍結,能保留產品原有的色澤。

表4 剝殼預處理對蝦pH值和色澤的影響Table 4 Effect of pretreatment on the pH and color of shrimps

2.5.2 對蝦仁質構的影響

質構特性極大地影響了消費者的可接受性,因此在產品的加工中起重要作用[22]。冷凍和酶處理剝殼后蝦仁的質構參數如表5所示,蝦仁的硬度、彈性、內聚性咀嚼性均有不同程度的變化。與鮮蝦相比,冷凍24 h后,蝦仁的硬度和咀嚼性顯著下降,彈性和內聚性無明顯變化,可能是冷凍后解凍,大冰晶的形成及融化造成蝦肉纖維組織結構被破壞[23],且由冷凍引起的肌原纖維蛋白的降解或結締組織的變化使持水性下降,蝦肉變軟[24-25]；而酶處理的蝦仁硬度只略微降低(P>0.05),這表明蛋白酶沒有過度水解蝦肉的肌原纖維和膠原蛋白,因為肌原纖維和膠原蛋白水解很大程度上會導致肌肉質地軟化[26]；彈性、內聚性、咀嚼性均顯著低于鮮蝦,咀嚼性和冷凍24 h相差不明顯,咀嚼性是硬度、黏性、彈性結合起來的綜合性質,猜測是在處理過程中2%的鈉鹽的作用,能夠輕微降低肌肉的硬度并較大程度地降低咀嚼性[27]。

表5 剝殼預處理對蝦仁質構的影響Table 5 Effect of pretreatments on the texture of shrimps

2.5.3 對肌肉組織微觀結構的影響

肌肉的微觀結構是對蝦肌肉品質變化的微觀表現,能直接反映肌肉組織細胞結構的完整性[28]。新鮮蝦仁的肌肉組織排列整齊彼此緊密相連,肌內膜表面光滑,呈典型的多邊型；肌束呈縱向排列,肌纖維排列致密,肌節豐滿,肌纖維束呈狹長柱狀(圖8-a1,圖8-a2)。冷凍24 h后剝殼的蝦仁,肌肉纖維之間的細胞外空間明顯增加,肌纖維的橫截面呈不同的碎裂形狀,肌內膜和肌束膜破裂；此外,一些肌肉纖維不連貫,甚至出現斷裂,肌節受到機械損傷明顯(圖8-b1,圖8-b2),這表明由于冷凍形成的冰晶大分子對肌肉組織結構的損傷較大。酶處理后的蝦仁,雖然肌肉細胞間的縫隙增大,但變化程度小于冷凍組；肌肉縱切面,肌纖維空隙略有增大,但并無出現大量斷裂現象,細胞維持著較好的完整性(圖8-c1,圖8-c2)。綜合來說,冷凍處理后剝殼對蝦仁肌肉結構破壞較為明顯,酶處理后剝殼則相對較為輕微。

a1-鮮蝦橫切片;a2-鮮蝦縱切片;b1-冷凍剝殼橫切片;b2-冷凍剝殼縱切片;c1-酶促剝殼橫切片;c2-酶促剝殼縱切片圖8 剝殼預處理對蝦仁微觀結構的影響(40×)Fig.8 Effect of pretreatments on microscopy of shrimp tissue

3 結論

自然pH值下,中性蛋白酶在對蝦便捷剝殼過程中發揮良好的酶促效果,所需剝殼單位功最少且剝殼效果好。優化得到酶促剝殼條件為：酶質量濃度0.7 mg/mL,料液比1∶10(g∶mL),酶解時間 3.5 h,在此條件下實驗得到的剝殼單位功為2.65 mJ/g,與理論預測值2.61 mJ/g基本一致,說明在該實驗范圍內建立的二次線性回歸模型準確有效,有一定的實用價值。該條件下酶液可重復使用3次,之后酶液活性減小至較低水平,且酶液顏色變暗。與鮮蝦仁相比,酶促剝殼對蝦仁pH及硬度影響不明顯,與冷凍剝殼后的蝦仁相比,b*與鮮蝦類似,顯著好于冷凍剝殼后的蝦仁,酶處理更能保持蝦肉的原有的色澤。微觀結構觀察表明冷凍處理對蝦仁纖維破壞較為明顯,酶處理后的蝦肉肌纖維較為完整,排列相對緊密,沒有出現肌內膜和肌纖維束斷裂的情況,說明酶促剝殼可顯著提高鮮蝦剝殼便捷性,保持蝦仁較好的品質,為促進對蝦機械剝殼的應用提供參考依據。