植物乳桿菌混菌發酵對梁平柚果酒理化性質及風味影響

易鑫,談安群,歐陽祝,王金凡,周琦,黃林華,王華*

1(西南大學 柑桔研究所,中國農業科學院柑桔研究所,重慶,400712) 2(成都市都江堰市春盛中藥飲品股份有限公司,四川 都江堰,611830)

梁平柚是我國三大名柚之一,與沙田柚、文旦柚齊名。其果肉淡黃色,酸甜可口,營養豐富。每100 mL梁平柚果汁中含蔗糖6.4 g、還原糖3.4 g、總酸0.21 mg、Vc111.7 mg和可溶性固形物14.1%[1]。柚子具有健脾胃、潤肺、補血、清腸、利便等功效,是具有食療效果的水果[2-3]。目前柚子主要用于鮮食,而一些次果被當作垃圾處理。若將次果加工成柚子果酒,則可促進柚類產業的多元化發展。

柚子果酒富含豐富的營養成分,較高地保留了原有的維生素、類黃酮等功效成分,更利于人體吸收。但目前影響柚子果酒品質的重要指標為酸味和風味,在一定程度上影響了消費者對產品的喜好程度,改善柚子果酒口感和風味已成為亟待解決的問題[2]。目前改善果酒酸味多采用化學降酸[3]、物理降酸[4-5]和生物降酸[6-7]?；瘜W降酸法主要有中和法(向果酒體系加入堿或堿式鹽)、離子交換樹脂等,但化學降酸很容易導致酒體不穩定或酒體風味損失[3]。物理降酸又稱低溫冷凍降酸,主要原理是隨著溫度的降低,酒體中的酒石酸及其鹽類結晶沉淀。但該法僅能降低酒石酸鹽的含量且降酸幅度較小,不適于其他有機酸的去除,且應用較有限,常用于酸度較高的葡萄酒生產[8]。生物降酸是利用微生物的生長代謝分解有機酸,從而達到降酸的目的,同時還能改進果酒體系的風味,成為現代降酸和提升風味的主要研究發展方向[9]。

目前,主要是添加酒酒球菌進行混菌發酵來降低酸度和提升風味。但WANG等[6]研究發現,添加酒酒球菌在果酒發酵過程中會產生大量的生物胺,引起安全問題。植物乳桿菌具有優秀的酶學特征和短暫的滯后期,可替代酒酒球菌,且能降低因發酵引起的生物胺含量增加的風險[6,10]。在含有大量檸檬酸的果實中如檸檬、柑橘、山楂等,植物乳桿菌可在發酵果酒中代謝檸檬酸等非糖物質,能顯著改善口感[11,13]。本研究以梁平柚次果為原料,研究植物乳桿菌不同接種量對梁平柚果酒理化指標、風味和口感的影響,最終選出合適的接種量,以期釀造出低酸高品質的柚子果酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柚子(梁平柚),西南大學柑桔研究所資源圃；白砂糖,市售；果酒酵母SY,安琪酵母公司；植物乳桿菌(LactobacillusplantarumCICC 20265),中國工業微生物菌種保藏管理中心；酵母浸粉、蛋白胨、納他霉素,上海麥克林生化科技有限公司；MRS培養基,大連美侖生物技術有限公司；L-蘋果酸、檸檬酸、L-酒石酸、L-乳酸、琥珀酸、草酸標準品,北京索萊寶科技有限公司；乙酸標準品,德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F潔凈工作臺,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養箱,蘇州市培英實驗設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器,上海博迅實業有限公司醫療設備廠；Ultimate3000高效液相色譜儀,美國戴安公司；氣相色譜-質譜聯用儀(Agilent 7890 GC-5977 MSD),美國Agilent公司；固相微萃取裝置(85 μm,CAR/PDMS),美國Supelco公司；阿貝折光儀,上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗設計

1.3.1 菌種活化

稱取50 mg果酒干酵母SY于250 mL三角瓶中,加入100 mL質量分數2%滅菌葡萄糖水,于35 ℃恒溫培養箱中預熱20 min,再置于30 ℃恒溫振蕩搖床于200 r/min下培養2 h,即得種子液。取植物乳桿菌單菌落接種到液體MRS培養基,置于37 ℃恒溫培養箱活化3代后,培養至對數中后期備用,約6 lgCFU/mL。

1.3.2 柚子果酒生產工藝流程

發酵在250 mL搖瓶中密封進行,每瓶裝有200 mL 經巴氏滅菌并過濾的柚子汁(糖度調至21°Brix),接種2%(體積分數)的果酒酵母SY,再分別接種0%、1%、2%、4%、6%、8%(體積分數,下同)的植物乳桿菌,28 ℃靜置發酵15 d,每組處理重復3次。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 柚子果酒基本理化指標測定

酒精度采用酒精計法,可滴定酸(以檸檬酸計)采用直接滴定法。以上檢測方法均參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法進行。

1.4.2 柚子果酒發酵主要產物測定

1.4.2.1 柚子果酒有機酸測定

有機酸含量測定參考李曦等[14]的方法稍作修改,發酵液8 000 r/min離心10 min,取1 mL上清液加入超純水稀釋5倍,再用0.45 μm水相濾膜過濾樣品進行HPLC分析。

測定條件：色譜柱為Venusil MP C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫30 ℃,進樣量20 μL,流速1 mL/min,波長220 nm,流動相為1 g/L磷酸。各有機酸標品回歸方程和相關系數見表1。

表1 各有機酸的回歸方程及相關系數Table 1 Regression equations and correlation coefficients of various organic acids

1.4.2.2 柚子果酒揮發性物質檢測

取5 mL待測柚子果酒于18 mL頂空瓶中,加入1.5 g NaCl,10 μL 81.9 mg/L的2-辛醇(內標物),充分振蕩溶解。40 ℃平衡20 min后插入SPME萃取頭萃取30 min,樣品在平衡和萃取過程中用磁力攪拌器以240 r/min輕輕渦旋,于250 ℃上機解析5 min,進行GC-MS分析。

氣相色譜條件：所用分析柱為TG-WAXMS(30 m×0.25 μm,0.25 mm),起始溫度40 ℃,保持3 min；再以6 ℃/min升至100 ℃；接著以10 ℃/min升至210 ℃,保持7 min；進樣口溫度250 ℃,不分流進樣；載氣He流速1.0 mL/min。質譜條件：EI離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；質量掃描范圍m/z40～400。

1.4.3 感官評價

由8名課題組訓練有素的小組成員(4名男性和4名女性)使用描述性分析來描述植物乳桿菌不同接種量發酵柚子果酒的感覺特征。參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》及YU等[12]的方法,將20 mL 20 ℃的梁平柚果酒試樣倒入感官杯中,用3個隨機數編碼,并以隨機順序呈現。小組成員將感官屬性定義為顏色、澄清度、梁平柚柚香、白蘭地酒香、酸度、甜味、澀味、苦味。梁平柚果酒用10分法非結構化標度進行分析,其中0分表示“不可感知”,10分表示“強烈可感知”,結果用平均值表示。

1.5 數據處理

所有試驗平行3次,試驗數據以平均值±標準差表示,用 Origin 2017 軟件進行作圖,通過SPSS 22.0統計軟件進行數據統計分析。

2 結果與討論

2.1 植物乳桿菌接種量對果酒理化指標的影響

2.1.1 植物乳桿菌接種量對柚子果酒酒精度的影響

植物乳桿菌接種量對酒精度的影響如圖1所示。隨著植物乳桿菌接種量的增加,柚子果酒酒精度先增加后降低,當接種量達到2%時柚子果酒酒精度達到最大,為12.4%vol。同時,觀察得到酵母菌數量與酒精度呈現正相關,當接種量為2%時,酵母菌菌落數最大為8.49 lg CFU/mL。植物乳桿菌數量則先增加后降低再升高,研究結果與CHEN等[15]的一致,酵母和乳桿菌間存在一個共生體系,酵母菌為乳桿菌的生長提供了許多營養因子,如氨基酸、維生素和丙酮酸鹽等,乳桿菌的代謝產物則為酵母菌提供能量。但若乳桿菌數量過多,其菌體繁殖迅速、代謝過于旺盛,則將抑制酵母菌的正常生長和代謝,進而影響酒精度[15]。

圖1 植物乳桿菌不同接種量對酒精度的影響Fig.1 Effect of different L.plantarum inoculations on alcohol content注:組間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

相反,若乳桿菌數量較少或是不足,大量酵母菌將會影響乳酸菌的正常生長和代謝,乳桿菌生長緩慢,導致整體菌體活力降低,對于乳酸的形成不利[18]。植物乳桿菌接種量為2%時,酵母菌和植物乳桿菌處于協同狀態,且酒精度最高(圖1)。

2.1.2 植物乳桿菌接種量對柚子果酒還原糖的影響

如圖2所示,隨植物乳桿菌接種量的增加,還原糖含量先降低后增加,含量在5.62～8.34 g/L。主要是因為隨植物乳桿菌接種量的增加,其先和酵母菌呈現協同作用,后因植物乳桿菌代謝過于旺盛,抑制了酵母生長,從而使還原糖消耗減少[15]。因此在植物乳桿菌接種量為2%時,柚子果酒還原糖含量最低,糖分利用完全,酒精轉化能力好。

圖2 植物乳桿菌不同接種量對還原糖含量的影響Fig.2 Effect of different L.plantarum inoculations on reducing sugars content

2.1.3 植物乳桿菌接種量對柚子果酒總酸的影響

果酒中的總可滴定酸和有機酸是導致果酒酸味的主要原因。因此,發酵過程應確?？偹峒案饔袡C酸適當,使果酒酸度適中、口感柔和[17]。植物乳桿菌不同接種量對柚子果酒總酸的影響如圖3所示,隨植物乳桿菌接種量的增加,柚子果酒總酸先降低后增加。研究表明果酒酸度較低時,酒體柔和、圓潤；較高時,酒體粗糙、澀口[18]。當植物乳桿菌接種量為2%時,柚子果酒總酸含量為2.34 g/L,顯著低于其他接種量酸度(P<0.05),能有效增加酒的爽口性與協調性。

圖3 植物乳桿菌不同接種量對總酸的影響Fig.3 Effect of different L.plantarum inoculations on total acid content

2.2 植物乳桿菌接種量對柚子果酒發酵主產物的影響

2.2.1 植物乳桿菌接種量對柚子果酒有機酸的影響

在果酒中,其基本品質,如感官、抗氧化能力、抗菌活性、pH值和色澤,都取決于有機酸的數量和類型[17]。研究表明,酒石酸具有類似于柑橘的味道,蘋果酸有金屬和青蘋果的味道,乳酸具有酸辣味,檸檬酸為清新宜人的柑橘味,琥珀酸具有酸、咸、苦的味道,各有機酸賦予果酒不同的感官特性[19]。植物乳桿菌不同接種量對柚子果酒有機酸含量影響如表2所示,7種有機酸中,蘋果酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸含量變化較為明顯。隨著植物乳桿菌接種量的增加蘋果酸含量從0.93 g/L降低到0.542 g/L；乳酸含量從0.213 g/L增至6.187 g/L；檸檬酸含量由4.562 g/L下降至0.713 g/L；琥珀酸含量從1.053 g/L增加至1.762 g/L?？赏茰y雖然柚子果酒中蘋果酸含量較少,但植物乳桿菌仍然進行了蘋果酸-乳酸發酵,將蘋果酸轉化為乳酸和二氧化碳[20]。而柚子果酒中有機酸主要以檸檬酸為主,植物乳桿菌主要進行了檸檬酸代謝,通過2-羥基羧酸鹽轉運蛋白運輸檸檬酸鹽,檸檬酸鹽在檸檬酸裂解酶復合物催化下轉化為草酰乙酸鹽,再經草酰乙酸脫羧酶脫羧產生丙酮酸,最后生成乳酸及芳香化合物[11,21-22]。琥珀酸含量的增加則被認為是乳酸菌通過其他代謝途徑從乳酸或檸檬酸代謝生成的[23]。

表2 植物乳桿菌不同接種量對柚子果酒中有機酸的影響Table 2 Effects of different L.plantarum inoculations on organic acids in pomelo wine

其他有機酸隨接種量的增加變化并不明顯,總有機酸量隨接種量增加呈現下降后增加趨勢。當植物乳桿菌接種量為1%時有機酸總含量最低，有為6.341 g/L,接種量為2%時次之，為6.775 g/L,但兩者無顯著性差異。同時研究表明適當的有機酸可平衡酒中的苦澀味,其含量過高則會導致果酒口感酸澀[2]。因此在植物乳桿菌接種量為1%和2%時,整體酸度較低,理論口感較好。

2.2.2 植物乳桿菌接種量對柚子果酒風味影響

經GC-MS分析后,植物乳桿菌接種量對梁平柚果酒風味影響如表3所示。不同接種量發酵果酒所含揮發性物質大致相同,共檢測出34種香氣物質,醇類10種、酯類13種、酸類3種、萜烯類5種、醛酮類2種以及其他物質1種。其中醇類種類占總揮發性物質的29.4%,酯類占總揮發性物質的38.2%,對酒體風味起到主要影響作用。

表3 植物乳桿菌不同接種量柚子果酒中香氣成分的含量 單位：μg/L

續表3

2.2.2.1 醇類物質分析比較

醇類主要是發酵過程中酵母等微生物作用于果膠質和氨基酸等轉化產生[24]。6種酒樣中共有的醇類為異丁醇、異戊醇、己醇、葉醇、芳樟醇、香芹醇和苯乙醇。異戊醇賦予酒樣果香和花香[18],其含量在酒樣中最高且差異較大,隨植物乳桿菌接種量增加呈現先增加后降低的趨勢,當接種量為2%時,其含量最大為787.13 μg/L。苯乙醇具有獨特的玫瑰香和月季花香,且具有一定殺菌能力[25],單一酵母發酵時其含量最大為208.42 μg/L,植物乳桿菌接種量為2%時次之,為191.62 μg/L,接種量為8%時,含量最低為145.29 μg/L。己醇給酒樣提供了青香和果香味[25],隨接種量的增加己醇含量先增加后降低,當接種量為2%時,其含量最大為146.69 μg/L。

當植物乳桿菌接種量為2%和4%時檢測出醇類物質最多,為10種。相較于單一釀酒酵母發酵多出了2-壬醇和2,3-丁二醇,2-壬醇具有青香味使得果酒風味更為豐富[26],2,3-丁二醇主要由于植物乳桿菌發酵積累[6]。從總醇含量上來看,接種量為2%時總醇含量最大,達到1 599.73 μg/L,顯著高于其他5種接種量(P<0.05),醇類風味更加濃郁,使酒體更加醇厚。

2.2.2.2 酯類物質分析比較

酯類化合物是構成果酒香氣的重要物質,酯類具有花、果香,對酒的主體香型及風格具有重要的影響[27]。柚子果酒中均檢測出辛酸乙酯,且含量最高。辛酸乙酯具有白蘭地酒香味,主要應用于調味品、香料制作等[28]。隨植物乳桿菌接種量的增加,辛酸乙酯含量先增加后降低,在接種量為2%時,辛酸乙酯含量最高為2 539.83 μg/L。接種量為1%時次之,為2 319.24 μg/L。主要的酯類化合物還有乙酸乙酯(水果味)、乙酸異戊酯(果香、香蕉香)、己酸乙酯(香蕉、青蘋果味)、乙酸己酯(蘋果、梨等水果味)、葵酸乙酯(水果、脂肪味)[28-29]。

6種柚子果酒中,總酯含量隨接種量的增加先增加后降低,當接種量為2%時,酯類種類最多,為12種,且總酯含量顯著高于其他組,為4 921.38 μg/L(P<0.05),酒體整體風味濃香,大大提高和豐富了梁平柚果酒的風味。

2.2.2.3 酸類物質分析比較

酸類物質在酵母發酵過程中形成,由醛基支鏈氧化形成酸[6]。酸類物質影響著果酒的口感和色澤,當酸類物質含量低于閾值時,對酒的感官有積極貢獻,可為果酒帶來新鮮感和平衡果香。高于閾值時,則會給香氣帶來負面影響[30]。在6種柚子果酒中,檢測出酸類物質有乙酸、己酸和辛酸。乙酸含量隨接種量的增加,先增加后降低,接種量為1%時,含量最高為98.55 μg/L。己酸有腐爛銀杏肉質外種皮難聞的氣味,對柚子酒樣風味有不良影響。但在梁平柚果酒中,其含量低于閾值。辛酸在低濃度時散發出類似奶酪和奶油的風味,在高濃度時具有腐敗味和刺激味[26]。其隨接種量的增加逐漸降低,單一酵母發酵含量較高,達183.94 μg/L。總酸含量也隨接種量的增加隨之降低,可推測植物乳桿菌在酒樣中分泌脂肪酶,進而改變柚子果酒中脂肪酸的含量[6]。綜上,添加植物乳桿菌相對于純發酵能有效降低梁平柚果酒中揮發性酸含量。

2.2.2.4 風味物質分析比較結果

從物質種類來看,當植物乳桿菌接種量為2%時,其風味物質最多,達到31種。且總醇和總酯含量最高,香型豐富。異戊醇(果香)、辛酸乙酯(白蘭地酒香)、葵酸乙酯(葡萄的水果香氣)、乙酸異戊酯(香蕉、青蘋果味)構成梁平柚果酒主要香味,輔以己醇(青香)、苯乙醇(玫瑰香)、己酸乙酯(菠蘿香)構成梁平柚果酒的特有香味。同時測定不同接種量果酒中的OAV，34種風味物質中，OAV>1的有8種，如表4所示。當添加2%的植物乳桿菌時，OAV均高于其他接種量。因此，當植物乳桿菌接種量為 2%時， 梁平柚果酒香氣成分復雜，賦予了梁平柚果酒優雅和諧的香味。

表4 植物乳桿菌不同接種量柚子果酒中揮發性物質的OAVTable 4 OAV of volatile substances in pomelo wine with L.plantarum inoculations

2.3 植物乳桿菌接種量對柚子果酒感官品質的影響

針對視覺、嗅覺、味覺方面的刺激對植物乳桿菌混菌發酵梁平柚果酒進行感官評價,如圖4所示。從外觀分析,酒樣顏色及透明度隨植物乳桿菌接種量的增加評分逐漸降低,這可能與植物乳桿菌在酒樣中細胞裂解有關,但各酒樣間差異不顯著。從香氣角度分析,隨接種量的增加,柚香和白蘭地酒香評分先增加后降低,接種量為2%時評分最高,這與辛酸乙酯和異戊醇濃度有關。從味覺分析,酸度和甜度評分均隨接種量的增加先降低后增加,這與理化指標測得有機酸和還原糖結果有關,當接種量為2%時,酸度和甜度評分均最低,口感最優?？辔对u分則隨接種量的增加逐漸降低?？傮w而言,感官評價結果與梁平柚果酒理化指標及揮發性化合物含量結果基本一致。當接種量為2%時各指標評分最優,同時相較于單一酵母發酵顯著提升了果酒的柚香和白蘭地酒香,降低了酸度、甜度和苦味。

圖4 植物乳桿菌不同接種量對柚子果酒感官品質的影響Fig.4 Effects of different L.plantarum inoculations on sensory quality of pomelo wine

3 結論

本試驗通過研究植物乳桿菌接種量對梁平柚果酒酒精度、還原糖、總酸、有機酸以及風味的影響,輔以感官評價,全方面研究及評價了不同接種量對梁平柚果酒的影響,最終確定植物乳桿菌接種量為2%時,釀造的柚子果酒最優。相較于單一釀酒酵母發酵,添加2%的植物乳桿菌將果酒酒精度從11.26%vol升高至12.4%vol,還原糖從6.63 g/L降低至5.62 g/L,發酵更加充分?？偹釓?.93 g/L降低至2.34 g/L,酸度顯著降低。進一步分析有機酸含量,蘋果酸從0.93 g/L降低至0.669 g/L,檸檬酸從4.562 g/L降低至1.696 g/L,乳酸從0.213 g/L升高至2.666 g/L,琥珀酸從1.053 g/L增長至1.337 g/L。有機酸總含量低于單一釀酒酵母發酵,平衡了有機酸含量并提高了口感。經GC-MS分析,檢測出揮發性物質34種,比單一發酵多7種,且醇類、酯類主體香氣含量均顯著高于單一發酵。梁平柚果酒主要香氣成分為辛酸乙酯、己酸異戊酯、異戊醇、己醇等,各香氣成分間相互協調,賦予了果酒獨特風味。接種量為2%時,梁平柚果酒酒體淺黃有光澤,酒體豐滿醇厚,酸度適中,具有獨特的梁平柚柚香和白蘭地酒香。綜上分析,2%的植物乳桿菌混菌發酵柚子果酒能顯著降低果酒酸度,并能有效提升果酒風味。