基于太赫茲光譜分析技術的肉類鑒別

楊少壯,李燦,李辰,3*,王志琪,黃略略

1(深圳華大生命科學研究院,廣東 深圳,518083) 2(深圳市太赫茲科技創新研究院,廣東 深圳,518102) 3(深圳麥科田生物醫療技術有限公司,廣東 深圳,518055) 4(深圳職業技術學院 應用化學與生物技術學院,廣東 深圳,518055)

肉類作為人類生活中重要的營養來源和能量補充物質,具有龐大的市場需求,在百姓生活中扮演著極為重要的角色。近年來,異種肉摻雜、低劣肉偽裝高檔肉、“僵尸肉”等肉類假冒偽劣和欺詐行為事件頻頻發生,嚴重影響消費者的健康和生活,更甚者涉及到宗教信仰問題,破壞社會安定。因此,開發高效、靈敏、快速的肉類鑒別技術尤其是對原料肉的鑒別檢驗方法和體系,有利于打擊肉類摻假和欺詐行為,具有非常重要的實用價值和社會意義。

目前,肉類鑒別技術主要包括傳統感官檢驗技術[1-3]、分析色譜[4-5]和電泳[6-7]等化學方法、基因學技術[8-9]、免疫學技術[10-11]等較為成熟的鑒別技術,在實際應用中也得到較為廣泛的應用,但仍受到樣品前處理流程繁雜、操作環境要求高、檢測設備不便攜等方面的限制。隨著高效靈敏的光譜分析技術和方法的不斷發展,極大提高了肉類檢測的效率,其中紅外光譜分析技術已經在肉類檢測中得到初步應用。同時,具有物質成分分析和細微結構檢測能力，可同時獲取多種光譜參數信息且無損的太赫茲光譜分析技術,也逐漸應用在相關的肉類檢測研究領域中,如利用太赫茲光譜區分不同的組織器官[12]、開展豬肉組織鑒別[13-14]、檢測豬肉K值以衡量其新鮮度[15]等肉類本身的識別與檢測研究。除此之外,也有相關單位利用太赫茲技術對肉類中可能存在的異物進行檢測[16],展現出了太赫茲技術較強的檢測能力和應用可行性。目前,關于太赫茲與肉類相關的研究,大部分都是采用新鮮組織作為測試樣品,實驗結果受水分的影響較大,測試結果穩定性和重復性不佳。主成分分析(principle component analysis,PCA)是面向模式分類的特征提取最典型的工具。PCA作為經典的特征提取方法,是在不減少原始數據所包含的內在信息前提下,將原始數據轉化為維數較少的“有效”特征成分來表示(俗稱降維),使其在統計均方意義下達到方差最優的目的[17]。支持向量機(support vector machine,SVM)是由Vapnik 提出的基于統計學理論的一種新的機器學習方法,屬于一種有監督的學習算法[18]。SVM在解決小樣本、非線性以及高維模式識別問題中表現出許多特有的優勢,它能夠克服“維度災難”,解決過學習問題,具有良好的分類準確性(由有限訓練樣本得到的決策規則對獨立的測試集仍能夠得到小的誤差)[19]。PCA與SVM結合可實現物質成分的有效識別。

本文基于太赫茲時域光譜技術(terahertz time domain spectroscopy,THz-TDS),一方面獲取不同部位新鮮組織的太赫茲時域/頻域信號強度差異,實現同種肉類不同部位之間的判別；同時借助真空冷凍干燥技術,在不破壞樣品分子結構和性質的前提下去除其中水分,通過定性分析不同凍干肉類在0.6～1.4 THz上的吸收系數、折射率、介電常數虛部和介質損耗角正切等多維光譜參數,結合主成分分析-支持向量機(principal component analysis and support vector machine,PCA-SVM),實現不同肉類的判別與鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮肉類,廣東深圳寶安家樂福超市(西鄉店),包括魚肉、雞肉和牛肉等3種不同品種肉類;品德鮮豬肉(帶有脂肪和皮膚)、茂峰豬肉和壹號土豬等3種不同品牌豬肉。(下文中若無特別說明,所述肉類樣品則均指瘦肉)FA2004B電子天平,HANGPING；ALPHA 1-4 LD冷凍干燥機,德國Christ；FW-100高速萬能粉碎機,北京市永光明醫療儀器有限公司；YP-5T壓片機,鶴壁市鑫利煤質分析儀器有限公司；RC-250B切片機,德國FEST；CCT-1800 THz-TDS,華訊方舟科技有限公司。

實驗所用檢測設備為THz-TDS儀,其系統結構如圖1所示。波長為780 nm的飛秒激光器輻射出的激光脈沖經二向色鏡后分成泵浦光和探測光,并分別輻射到LT-GaAs為襯底的光電導天線上,從而實現太赫茲波的激發和探測。其中,L1、針孔和L2組合而成的空間濾波器用于縮小激光光束和濾除高頻噪聲,提高光束質量。光學延遲線主要是由反射鏡和移動電機構成,用于調節泵浦光和探測光之間的相對延遲時間,實現太赫茲波的相干探測。另外,為了減少測試時水汽帶來的干擾,對測試倉進行密封處理,測試過程中可往其中吹掃氮氣排除水汽,以提高測試效果。氮氣環境下,系統的空載時域信號和頻域譜線如圖4中參考信號所示,具有較高的帶寬和信噪比[20-21],適用于太赫茲光譜探測和分析。

L1,L2-聚光鏡；M1～M5-反射鏡；PM1,PM2-拋物面鏡圖1 THz-TDS系統原理圖Fig.1 Schematic diagram of the THz-TDS

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 切片

將新鮮樣品清洗干凈,并用無塵紙巾吸干表面水分,利用切片機、家用切肉刀和砧板等工具獲取若干不同組織和肉類樣品,厚度均為0.8 mm,面積約為6 cm2。其中,不同組織包括品德鮮豬的脂肪、皮膚和瘦肉,不同肉類均為瘦肉,包括魚肉、雞肉、牛肉、品德鮮豬、茂峰豬和壹號土豬6種,如圖2-A～F所示,可以發現,不同肉類之間并無非常明顯的差異特征,無法僅憑外觀和氣味對其精準識別。

新鮮狀態：A-魚肉;B-雞肉;C-牛肉;D、D1和D2分別為品德鮮豬的瘦肉、脂肪和皮膚;E-茂峰豬;F-壹號土豬；a1～f1和a2～f2分別對應不同肉類的凍干狀態和壓片形式圖2 不同生物組織樣品的實物圖Fig.2 The photos of different biological tissue samples注:切取瘦肉時需避開骨頭和脂肪,并剔除其中的筋膜等,保證所有肉類均為瘦肉,以確保實驗結果的可靠性和統一性

1.2.1.2 凍干

每個樣品取出16片,按數量平均分成4份,進行冷凍干燥去除水分。首先,物料提前放入-35 ℃的速凍冰箱中凍結10 h,然后放入凍干機中進行冷凍干燥,真空度為20 Pa,冷阱溫度為-53 ℃,加熱板溫度為30 ℃,凍干時間為30 h。在不損壞樣品結構的前提下徹底去除其中含有的水分,凍干后樣品如圖2中a1～f1所示。利用電子天平稱取凍干前后的樣品質量,記錄。

1.2.1.3 壓片

利用高速萬能粉碎機,將凍干后的肉類進行粉碎處理,然后在電子天平上,稱取約200 mg粉碎后的肉類樣品,利用壓片機制成直徑約為13 mm的圓形狀壓片,如圖2中a2～f2所示。

1.2.2 樣品含水量測試

研究表明,皮膚的主要組成成分為膠原蛋白,瘦肉的基本成分則是肌纖維蛋白,分布在蛋白質分子表面的極性基團與水分子之間存在靜電引力而形成水殼層結構,因此皮膚和瘦肉含水量較高[22]。而由甘油三酯混合物構成的脂肪,屬于疏水物質,含水量低[14]。將凍干前后稱取的樣品質量分別代入公式(1),可獲得不同樣品的含水量。

(1)

式中:ma、mb分別表示樣品在凍干后和凍干前的質量,g。

1.2.3 不同樣品的太赫茲光譜測試

測試樣品包括不同組織(脂肪、皮膚和瘦肉)和不同肉類(均為瘦肉),由于太赫茲波對水具有非常強的吸收特性,導致含水量高且比例相近的新鮮肉類透射信號的強度和信噪比偏低,影響測量結果的精準性。因此,實驗中采用凍干-壓片的不同肉類進行檢測。而不同組織之間含量差異明顯,利用太赫茲波的信號強度差異可明顯區分,因此直接采取測量新鮮組織的方式進行實驗。

在THz-TDS透射模塊下,持續向測試樣品中吹掃氮氣,獲取空載條件下的參考信號。將1.2.1小節中獲取到的新鮮組織和凍干肉類壓片分別置于樣品架上,對其進行太赫茲光譜采集。楊航等[14]通過觀察脂肪、皮膚和瘦肉在脫水過程中的太赫茲光譜信號變化發現,在分析含水量較低的組織樣品時,其吸收系數和折射率可作為參考指標。而介電常數虛部與物質在電場的弛豫極化相關,介質損耗角正切反映電磁能量轉化為其他能量時在其內部引起的能量損耗,這兩個參數在生物表征中起到重要作用[23]。因此,除了吸收系數和折射率外,下文中還引入介電常數虛部和介質損耗角正切這2個關鍵參數,通過多維光譜參數分析實現對不同肉類的精準檢測。

1.2.4 太赫茲光譜參數計算

假設THz-TDS的參考信號為Eref(ω),樣品(厚度為d)的信號為Esam(ω),則根據太赫茲光學參數模型[24]可求得樣品對THz波的光譜響應函數H(ω)：

=A(ω)e-iφ(ω)

(2)

(3)

(4)

根據上述公式，樣品的介電常數ε*(ω)和介質損耗角正切tanδ如公式(5)(6)所示：

(5)

(6)

式中:ε′(ω)、ε″(ω)分別表示所測樣品的介電常數實部和虛部。

1.2.5 分析方法和處理工具

通過1.2.3小節和1.2.4小節可獲取到不同樣品的時域信號、頻域信號、吸收系數、折射率、介電常數(虛部)、介質損耗角正切等太赫茲光譜參數信息。其中,新鮮組織之間的含水量相差較大,可直接通過比較其時域/頻域信號強度差異來進行區分；而不同凍干肉類的檢測則需結合多維光譜參數之間的差異進行分析評價,使得鑒別結果更加精準可靠。首先,選取有效頻段上的光譜數據,以0.1 THz為間隔,獲取各光譜參數與頻率之間相關性圖,并進行定性分析。然后,在選取頻段上對各肉類樣品的光譜數據做統計分析,加以區分判別。

原始數據中,部分數據較為接近或重疊,僅憑數據差異無法進行有效區分和判別。PCA通過數據降維的方式對原始數據進行有效的壓縮處理,使得樣品的共有信息中相互重疊的部分得以消除,實現特征信息提取和分析,然后建立SVM分類模型,從而對樣品進行精準判別和分類[25-26]。在分析中,常以貢獻率的多少來表征該主成分包含的信息,其中,第一主成分往往貢獻最大,最能體現樣品特征信息,依此類推。因此,通過對不同肉類的光譜數據進行PCA處理和建立SVM多分類模型分析,對不同肉類差異進一步展開深入分析和討論。

實驗中,采用MATLAB R2016a以及LIBSVM v3.22工具箱實施數據的PCA-SVM分析；采用Origin 2018和Excel 2010對數據進行統計、分析并繪制成圖。所有實驗中,均制備4個相同類型的樣品,其實驗結果的均值作為該樣品的最終測試結果,從而排除因個體差異造成的干擾。

2 結果與分析

2.1 不同來源及品種肉質的含水量分析

如圖3所示,不同來源和品種肉質的含水量為70%～80%,其中牛肉含水量最少,魚肉含水量最高,該結果也與相關文獻報道基本吻合[27-28]。不同肉質之間雖具有一定的含水量差異,而個別品種肉質按公式(1)所測得的含水量誤差較大,使得肉質含水量不具有較強的差異性和特征性。因此僅依靠所測含水量之間的差異,針對不同來源和品種肉類之間區分難度較高。

圖3 不同來源及品種肉質中含水量的對比Fig.3 The comparison of water content of meat from different origin and varieties

2.2 肉質的太赫茲光譜分析

不同肉質的太赫茲時域信號和頻域光譜如圖4所示,通過比較不同肉質的時域信號峰值和0.2 THz處的頻域光譜信號強度,可發現不同肉質的THz波形、隨延遲時間變化的時域信號強度、隨頻率變化的頻域信號強度均存在明顯差異。THz波的信號強度差異主要受組織含水量的影響,含水量越高,則透過組織的THz信號越弱,通過不同肉質的THz時域信號相比參考信號強度分別衰減了98.69%、96.02%、89.15%,該結果與相關的文獻報道一致[13-14]。因此,基于THz對不同肉質內水分的強衰減特性,利用THz-TDS技術可對不同肉質進行快速精準判別。

a-THz時域信號；b-對應的頻域光譜曲線圖4 新鮮狀態下不同組織的太赫茲光譜信息Fig.4 The terahertz spectra of different types of fresh tissue

2.3 不同來源及品種肉質的太赫茲光譜分析

2.3.1 光譜參數定性分析

在0.6～1.4 THz頻率范圍內,以0.1 THz為間隔,不同肉類的太赫茲光譜參數如圖5所示。不同肉類組織的太赫茲光譜參數與頻率之間均存在相關性變化,除了折射率隨頻率的增大而減小外,其余的光譜數值均隨頻率的增大而增大,同時所測肉類的光譜都沒有特征吸收峰或明顯的突變,主要原因是由于肉類成分的復雜性,其中包含的氨基酸和核苷酸等生物分子對太赫茲波的響應相互交疊,單一特征性質不明顯[29-30]。從光譜數值上看,凍干后不同肉類的折射率在1.66～1.82,彼此之間差異明顯,可作為肉類的定性指標；而關于吸收系數、介電常數虛部和介質損耗角正切,魚肉、雞肉、牛肉、品德鮮豬、茂峰豬等肉類之間可以實現較好的區分,壹號土豬則易于與其他肉類產生混淆。由此表明,凍干處理后的不同肉類,其主要組成分子、結構、元素含量等方面成分信息仍存在差異,從而導致其太赫茲光譜之間的區別。

a-樣品的吸收系數；b-折射率；c-介電常數虛部；d-介質損耗角正切值圖5 凍干狀態下不同肉類的太赫茲光譜信息Fig.5 Terahertz spectra of different kinds of freeze-dried meat

求取0.6～1.4 THz上的光譜參數平均值和最小/最大值,其結果分別如表1和表2所示。不同肉類的平均THz光譜參數統計值均有明顯差異,直觀上(圖5)與其他肉類樣品光譜數據重疊的壹豬土豬,在光譜參數的多種平均值上,壹號土豬與其他肉類,也可實現較好的區分。由此可見,通過結合不同肉類的多維太赫茲光譜參數差異,進行定性分析和統計值處理(均值、最小/最大值),可實現不同品種和同品種不同品牌肉類之間的鑒別。同時,引入介電常數虛部和介質損耗角正切的多維度參數分析方法,也可有效避免因某一參數的交叉重疊而導致區分度較低的情況,提高測試結果的精準性。

表1 不同肉類在0.6～1.4 THz上的光譜參數平均值Table 1 Average values of spectral parameters of different kinds of meat at 0.6～1.4 THz

表2 不同肉類在0.6～1.4 THz上光譜參數的最小值和最大值Table 2 The minimum and maximum values of spectral parameters of different kinds of meat at 0.6～1.4 THz

2.3.2 光譜參數PCA-SVM分析

為了更全面地探索太赫茲時域光譜對6種不同肉類的鑒別能力,研究不同光譜參數對肉類鑒別分類的能力,對不同肉類凍干狀態下所得4種光譜參數(吸收系數、折射率、介電常數虛部及損耗角正切值)在0.6～1.4 THz頻段的光譜數據實施PCA-SVM分析。

首先提取該頻段原始光譜數據進行PCA降維,如圖6所示為不同肉類凍干狀態下4種光譜參數數據的PCA得分圖,結果顯示第一、二主成分(PC1和PC2)的累計貢獻率已達98%以上,可代表原始數據進一步分析。

a-樣品的吸收系數；b-折射率；c-介電常數虛部；d-介質損耗角正切值圖6 不同肉類在凍干狀態下,4種光譜參數數據的PCA得分圖Fig.6 PCA scores plots of four different groups of THz spectral data measured from six different kinds of freeze-dried meat samples

利用任意1種光譜參數數據的進行多分類SVM分析中,運用隨機化函數隨機抽取不同肉類數據各25條數據(共150條)作為訓練集,建立當前光譜參數的SVM多分類模型；利用該模型對未知分類的測試集(共30條)進行分析。6種不同肉類的訓練集數據樣本和測試集數據樣本的數據分布如表3所示。

表3 SVM分析中6種不同肉類的數據分布Table 3 Data distribution of six different meat samples in the SVM analysis

本研究中SVM分類模型均采取徑向基函數作為核函數,利用三折交叉驗證(K-CV,K=3)和網格劃

分搜索的方法尋找最佳的懲罰參數c、核函數參數g,使K-CV方法過程中取得最高訓練集分類準確率和最優分類器性能,避免過學習和過擬合狀態發生。表4為獲得的SVM模型最優參數及對應的訓練集分類準確率。

表4 SVM模型的最優參數c&g及對應的訓練集準確率Table 4 Best obtained parameter c&g of SVM models and corresp.train accuracy

為了驗證SVM模型對不同肉類的分類預測性能,取不同肉類數據各5條數據(共30條)作為測試集,利用4種光譜參數下建立的SVM模型分別進行預測識別,可得到如圖7所示的測試集樣本分類結果及對應的測試集分類準確率。

a-樣品的吸收系數；b-折射率；c-介電常數虛部；d-介質損耗角正切值圖7 不同肉類太赫茲光譜參數的測試集樣本的分類結果圖Fig.7 Classification result of test data-sets of terahertz spectra of different kinds of meat注:類別標簽：0-魚肉;1-雞肉;2-牛肉;3-品德鮮豬;4-茂峰豬;5-壹號土豬肉(下同)

結果顯示,利用4種光譜參數,即吸收系數、折射率、介電常數虛部以及損耗角正切值光譜數據建立的4個SVM模型,測試集分類準確率分別達到96.67%、96.67%、93.33%和90%。同樣對測試集30個樣本進行預測分類,吸收系數和折射率建立的SVM模型均僅有1例誤判,介電常數虛部和損耗角正切值建立的SVM模型分別有2例和3例誤判,說明利用吸收系數和折射率建立的SVM模型對不同肉類的預測分類更準確,能夠正確無誤的對魚肉、雞肉、牛肉、品德鮮豬進行預測分類；介電常數虛部SVM模型更適用于雞肉、牛肉、品德鮮豬的準確分類；損耗角正切值更適用于魚肉、雞肉、牛肉的準確分類。不同肉類的太赫茲光譜參數的測試集分類準確率均在90%及以上,說明根據不同光譜參數均能夠對肉類進行準確分類識別,這也為肉類的檢測提供了一個有效的鑒別分析方法。

上述誤判中來自茂峰豬肉與壹號土豬肉之間的誤判有5例,占誤判總數的71%,說明茂峰豬肉與壹號土豬肉相對于其他肉類類別更容易相互混淆,考慮這2種肉類在所有光譜參數的SVM分類情況,茂峰豬肉和壹號土豬肉的誤判率分別為15%和10%,混淆誤判率高達12.5%。為了提高太赫茲光譜參數數據對茂峰豬與壹號土豬2種豬肉樣本的鑒別能力,我們提取2種豬肉樣本的PCA降維數據進行歸一化([0,1] 區間)處理后,建立SVM二分類模型,如表5所示,K-CV方法下取最佳參數均可獲得100%的訓練集驗證分類準確率。利用上述參數建立SVM模型,對測試集樣本進行預測識別。如圖8所示,僅介質損耗角正切數據所得測試集分類準確率為90%,其余3種光譜參數均可獲得100%分類準確率；茂峰豬肉與壹號土豬肉的混淆誤判率已降低至2.5%,其中茂峰豬肉的誤判率為0,壹號土豬肉的誤判率為5%,相比于未歸一化處理直接實施SVM分類的誤判率均有所降低。因此,有效的歸一化處理方法,可有助于降低2種豬肉之間的混淆誤判率,提高PCA-SVM方法的分類準確率。

表5 SVM二分類模型的最優參數c&g及訓練集準確率Table 5 Best obtained parameter c&g of SVM binary classification models and corresp.train accuracy

a-樣品的吸收系數；b-折射率；c-介電常數虛部；d-介質損耗角正切值圖8 兩種豬肉太赫茲光譜參數的測試集樣本的分類結果圖Fig.8 Classification result of test data-sets of terahertz spectra in two pork samples

3 結論與討論

本文基于太赫茲光譜分析技術,對不同新鮮組織和凍干肉類進行太赫茲光譜檢測,并結合多維光譜參數定性分析和PCA-SVM算法等方法對其進行差異表征,實現不同生物組織之間的精準鑒別。研究表明,含水量差別較大的組織(脂肪、皮膚、瘦肉),可直接通過檢測其新鮮狀態下的太赫茲時域信號和頻域光譜強度差異進行快速檢測鑒別；而針對含水量較高且差異較小的肉類,可結合真空冷凍干燥技術去除水分,對不同肉類在0.6～1.4 THz波段上的吸收系數、折射率、介電常數虛部和介質損耗角正切值等多維光譜參數進行定性分析以及建立PCA-SVM分類模型,可以實現不同肉類之間的鑒定。該結果展示了太赫茲光譜分析技術在不同組織、不同品種及同品種不同品牌肉類鑒別上的檢測能力,有望在肉類摻假等實際應用場景中發揮作用,為打擊肉類摻假和欺詐行為提供高效精準的鑒別手段。